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研究背景和目的:光动力学疗法(PDT)是近30年发展起来的一种治疗恶性肿瘤的新方法。它与手术、化疗和放疗三大传统肿瘤治疗手段相比,具有选择性高,能定向消灭肿瘤,对正常组织损伤少,毒副作用小;可与化疗和放疗同时进行,对各种实体肿瘤均有疗效并可重复治疗等优点。PDT的关键因素是光敏剂,早期的PHOTOFRIN(R)有许多致命的弱点,肿瘤选择性摄取率不高;成分复杂、组成不稳定,来源困难等;疗效不稳定,临床应用受到限制。因此开发新型高效低毒的抗肿瘤光敏剂一直是PDT研究的热点。
DVDMS化合物属于以醚键结合的卟啉二聚体盐,其主要成分DVDMS-2是一个化学结构明确、水溶性强、性质稳定的新型光敏剂。本文旨在通过研究DVDMS-2的光谱学特性,建立其在生物样本中含量的测定方法,检测DVDMS-2在肿瘤动物模型中药代动力学特性;并通过DVDMS-2-PDT的抗肿瘤活性及其机制研究,探讨其在肿瘤治疗中的应用前景。
研究方法:首先,通过紫外分光光度计和荧光分光光度计研究DVDMS-2的光谱特征,并对其溶剂体系进行优化筛选。以PBS:甲醇(v/v1∶2)为溶剂萃取生物样本中DVDMS-2,建立生物样本DVDMS-2荧光定量检测新方法,并利用标准浓度对DVDMS-2荧光定量法进行特异性、精密度、准确度、回收率、检测限等的方法学评价。其次,建立小鼠H22皮下肿瘤模型,尾静脉注射高中低三种剂量(1、2、4mg/kg)的DVDMS-2后,应用荧光光度计法检测生物样本中DVDMS-2浓度,采用Winnonlin药代动力学软件包拟合。最后,CellTiter-Blue(R)Cell Viability Assay法检测DVDMS-2对肿瘤细胞的光动力杀伤活性;用小鼠H22皮下肿瘤模型检测DVDMS-2-PDT的抗肿瘤活性;共聚焦荧光显微镜观察肿瘤细胞对DVDMS-2的摄取随时间变化关系;AnnexinV/PI双染结合荧光显微镜和流式细胞仪观察检测DVDMS-2-PDT对肿瘤细胞杀伤模式。
实验结果:(1)DVDMS-2在PBS中的紫外光谱特性:在200～700nm,有4个吸收峰(223、374、526、588nm),λmax=374nm,溶剂中血清的加入对检测无影响,检测限为4μg/mL;在PBS中的荧光光谱特性:Ex=408nm;Em=628～631nm,血清的加入使荧光强度大幅增强。(2)建立了DVDMS-2荧光定量检测方法,检测条件:PBS:甲醇(v/v1∶2)为提取溶剂,LS-55荧光光度计Ex=408nm;Em=628～631 nm测定生物样本中DVDMS-2。线性关系良好,各组织相关系数(r)均大于0.996,检测下限可达20ng/mL。(3)DVDMS-2在荷瘤小鼠体内的药代动力学行为符合二室模型;高中低剂量(1,2,4mg/kg)的分布相半衰期(T1/2α)分别为0.11h、0.13h、0.42h,消除相半衰期(T1/2β)分别为7.68h、4.31h、6.82h。DVDMS-2单剂量(2mg/kg)静脉注射后迅速分布于全身各组织,给药后12h,肿瘤中药物浓度达到峰值。24h后,各组织基本消除,肿瘤药物浓度保持峰值的80％,肿瘤与其周边皮肤和肌肉的药物分布比分别为7∶1和5∶1。(4)DVDMS-2对不同肿瘤细胞株均有显著的杀伤作用(IC50在0.20～0.831μg/mL范围内),杀伤作用在一定范围内与光敏剂浓度和光照剂量呈正相关;DVDMS-2-PDT14天后小鼠肿瘤消失,DVDMS-2-PDT对荷H22瘤小鼠的抗肿瘤作用显著;在DVDMS-2孵育5h细胞对药物的摄取达到峰值;AnnexinV/PI双染分析结果显示,低PDT剂量主要诱导肿瘤细胞凋亡,细胞凋亡率可达19.47％,坏死率只为5.98％;高PDT剂量主要诱导坏死,细胞坏死率可达85.74％,凋亡率只为3.78％。
结论:(1)DVDMS-2的紫外和荧光光谱与其他血卟啉类药物的光谱学特征相同。(2)本文建立的生物样本DVDMS-2荧光定量测定法具有灵敏、快速、重现性好等特点。(3)DVDMS-2在荷瘤小鼠体内的药代动力学符合二室模型;并且DVDMS-2能选择性聚集并较长时间潴留于肿瘤组织,光动力治疗的最佳时间为静脉注射后12h至24h。(4)DVDMS-2-PDT对体内外肿瘤均表现出显著的抗肿瘤活性,体外杀伤作用呈药物和光剂量依赖性;体外PDT最佳实验参数:1μg/mL DVDMS-2,避光孵育5h,光剂量10J/cm2;(5)DVDMS-2-PDT对肿瘤细胞的杀伤是通过诱导细胞凋亡和坏死双重模式进行。