在间质性肺疾病(interstitial lung disease,ILD)中特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是最常见类型,目前IPF的发病率呈增多趋势。美国胸科学会(ATS)和欧洲呼吸学会(ERS)推荐的治疗方法中,目前为止临床上均缺乏足够证据其有效性,并且IPF平均生存时间仅约3年左右,所以探索新的并且有效的治疗IPF方法是目前非常紧迫而艰难的课题。最近的研究证实,羧胺三唑(Carboxyamidotriazole,CAI)不但可以抗肿瘤,而且具有抗炎作用,国内外有学者报导羧胺三唑可以减少IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎细胞因子浸润,抑制滑膜增生,对大鼠佐剂性关节炎有治疗作用,亦报道了羧胺三唑具有抗炎镇痛作用。一位学者在博士论文中从调节肺纤维化形成过程中的一些细胞因子角度报道了羧胺三唑对博莱霉素致小鼠肺纤维化的治疗作用,对羧胺三唑抗肺纤维化的作用机制做了初步探讨,细胞因子网络庞大而复杂,有众多信号通路,羧胺三唑影响的细胞因子从哪些信号通路起抗纤维化作用?除了该文中检测出的细胞因子以外,羧胺三唑是否还调节了其他细胞因子抗肺纤维化?多大的羧胺三唑剂量能起最佳的抗肺纤维化效果?国内外尚未见相关报道。从这些问题出发设计了该实验,更进一步探讨羧胺三唑拮抗小鼠肺纤维化作用。实验一目的不同博莱霉素给药方式致小鼠肺纤维化模型的比较,以选用最为简便及成模率高同时肺纤维化在肺组织中分布均匀的方法,从而为下一步研究奠定基础。方法将20只小鼠随机分成五组,气管内造模组(气管内组):一次性气管内滴注博莱霉素3.5 mg/kg;尾静脉造模1组(尾静脉1组):一次性尾静脉内注射博莱霉素80mg/kg(0.2ml);尾静脉造模2组(尾静脉2组):一次性尾静脉内注射博莱霉素150mg/kg(0.2ml),尾静脉造模3组(尾静脉3组):一次性尾静脉内注射博莱霉素300 mg/kg(0.2ml);空白对照组(空白组):一次性尾静脉内注射生理盐水0.2 ml。观察指标:小鼠一般情况,小鼠死亡情况,肺脏外观,肺组织病理切片,肺组织羟脯氨酸含量测定。结果1、28天时死亡率由高到低依次为尾静脉-3组(75%)、尾静脉-2组和气管内组(均为50%)、尾静脉-1组(25%)、空白组(无死亡)。2、HE染色肺组织病理标本纤维化程度由重到轻依次为尾静脉-3组、尾静脉-2组和气管内组、尾静脉-1组、空白组,空白组未见肺纤维化。3、各组小鼠肺组织中羟脯氨酸含量从高到低依次为尾静脉-3组(0.621μg/mg)、尾静脉-2组(0.599±0.015μg/mg)、气管内组(0.572±0.019μg/mg)、尾静脉-1组(0.512±0.012μg/mg)和空白组(0.439±0.009μg/mg)。结论尾静脉注射博莱霉素150 mg/kg肺纤维化模型具有方法简便,重复性好,病死率低,纤维化病变均匀分布在胸膜下等特点,值得推广。实验二目的探索不同剂量的羧胺三唑对博莱霉素致小鼠肺纤维化的治疗作用,探寻出最佳羧胺三唑的剂量。方法将50只小鼠随机分为五组,每组各10只小鼠:空白对照组(空白组):一次性尾静脉内注射N.S.0.2 ml后,给予PEG400溶液0.1ml/10g灌胃,每天一次,连续14天;博莱霉素组(BLM组):一次性尾静脉内注射博莱霉素150 mg/kg(0.2ml),尾静脉内注射博莱霉素后2 h,给予PEG400溶液0.1 ml/10g灌胃,每天一次,连续14天;羧胺三唑-1组(CAI-1组):一次性尾静脉内注射博莱霉素150 mg/kg(0.2ml),尾静脉内注射博莱霉素后2 h,给予羧胺三唑溶液0.1 ml/10g(羧胺三唑溶液10 mg/kg)灌胃,每天一次,连续14天;羧胺三唑-2组(CAI-2组):一次性尾静脉内注射博莱霉素150 mg/kg(0.2ml),尾静脉内注射博莱霉素后2 h,给予羧胺三唑溶液0.1ml/10g(羧胺三唑溶液20mg/kg)灌胃,每天一次,连续14天;羧胺三唑-3组(CAI-3组):一次性尾静脉内注射博莱霉素150mg/kg(0.2ml),尾静脉内注射博莱霉素后2 h,给予羧胺三唑溶液0.1 ml/10g(羧胺三唑溶液40mg/kg)灌胃,每天一次,连续14天。观察指标:小鼠一般情况,体重,肺系数,小鼠生存分析,肺组织病理切片,肺组织羟脯氨酸含量测定,检测肺组织匀浆中的细胞因子TGF-β1和IFN-γ含量。结果1、体重各组各时点体重比较如下:第7天时,各组体重明显低于空白组(P<0.05),三个羧胺三唑组和博莱霉素组体重相近(P>0.05)。第14天时,各组体重仍低于空白组(P<0.05),除博莱霉素组外,三个羧胺三唑组小鼠体重已经开始稳步增加,其中羧胺三唑-3组体重增加明显,与博莱霉素组比较有统计学意义(P<0.05)。第28天时,除博莱霉素组外,三个羧胺三唑组小鼠体重较博莱霉素组平稳增加(P<0.05),其中羧胺三唑-3组小鼠增加最多。2、肺系数各组各时间点肺系数比较如下:第28天时,博莱霉素组和羧胺三唑组肺系数明显高于空白组(P<0.05),博莱霉素组和三个羧胺三唑组肺系数依次降低,羧胺三唑-3组最低,其中羧胺三唑-2组和羧胺三唑-3组小鼠肺系数与博莱霉素组比较有统计学意义(P<0.05),羧胺三唑-1组和羧胺三唑-3组小鼠肺系数比较有统计学意义(P<0.05)。3、小鼠生存分析28天死亡率由高到低依次为博莱霉素组和羧胺三唑-1组(均为50%)、羧胺三唑-2组(40%)、羧胺三唑-3组(为30%)、空白组(无死亡)。平均生存天数正好与前者相反。从生存曲线来看,博莱霉素组和羧胺三唑-2组和羧胺三唑-3组生存曲线明显分开,在3个治疗组之间,前14天有部分重叠,14天之后生存曲线彼此分开。4、实验第28天时各组HE染色肺组织病理标本纤维化程度由重到轻依次为博莱霉素组、羧胺三唑-1组、羧胺三唑-2组、羧胺三唑-3组、空白组,空白组未见肺纤维化。将病理切片编秩,五组之间两两比较均有统计学意义(P<0.05)。Masson染色中空白组小鼠第28天肺组织图片,血管周围见少量蓝色胶原纤维;博莱霉素组见大片的肺实变,大量炎症细胞浸润,中间见到大等量蓝色胶原沉积;羧胺三唑1~3组小鼠第28天肺组织图片,肺组织实变、炎细胞浸润和蓝色胶原沉积逐渐减轻。28天时小鼠肺组织胶原染色后胶原纤维面积占视野肺组织面积的百分比五组之间两两比较均有统计学意义(P<0.05)。5、第28天时各组小鼠肺组织羟脯氨酸含量和肺组织匀浆中TGF-β1含量由高到低依次为博莱霉素组、羧胺三唑-1组、羧胺三唑-2组、羧胺三唑-3组和空白组,肺组织匀浆中IFN-γ含量由高到低依次为羧胺三唑-3组,羧胺三唑-2组,羧胺三唑-1组,博莱霉素组,空白组。五组之间两两比较均有统计学意义(P<0.05)。结论羧胺三唑可减轻博莱霉素致小鼠的肺纤维化,胃内灌注羧胺三唑溶液40 mg/kg效果更佳,作用机制与羧胺三唑对TGF-β1和IFN-γ等细胞因子的影响有关。实验三目的探讨基于TGF-β/smad信号转导通路的羧胺三唑对博莱霉素致小鼠肺纤维化的治疗作用,并检测在抗纤维化过程中可能调节的细胞因子,对抗纤维化作用的机制做进一步探讨。方法将45只小鼠随机分为三组,每组各15只小鼠:空白组:一次性尾静脉内注射N.S.0.2 ml后,给予PEG400溶液0.1 ml/10g灌胃,每天一次,连续14天;后给予N.S.0.2 ml腹腔注射,每天一次,直到小鼠被处死。博莱霉素组:一次性尾静脉内注射博莱霉素150 mg/kg(0.2ml),尾静脉内注射博莱霉素后2 h,给予PEG400溶液0.1 ml/10g灌胃,每天一次,连续14天。羧胺三唑组:一次性尾静脉内注射博莱霉素150 mg/kg(0.2ml),尾静脉内注射博莱霉素后2 h,给予羧胺三唑溶液0.1ml/10g(羧胺三唑溶液40 mg/kg)灌胃,每天一次,连续14天。观察指标:小鼠一般情况,体重,肺系数,小鼠生存分析,肺组织病理切片,肺组织胶原染色,肺组织羟脯氨酸含量测定,检测肺组织匀浆中的细胞因子TGF-β1、IFN-γ、MMP-9和TIMP-1含量,肺组织免疫组化染色检测信号通路中TGF-β1、smad2和smad3的表达情况,Western blot检测肺组织信号通路中TGF-β1、smad2和smad3的表达量。结果1、体重第7天时,博莱霉素组和羧胺三唑组小鼠体重明显低于空白组(P<0.05),羧胺三唑组和博莱霉素组体重相近(P>0.05)。第14天时,博莱霉素组和羧胺三唑组小鼠体重低于空白组(P<0.05),羧胺三唑组小鼠体重已经开始稳步增加,与博莱霉素组比较有统计学意义(P<0.05)。第28天时,博莱霉素组和羧胺三唑组小鼠体重仍低于空白组(P<0.05),且差距拉大,羧胺三唑组小鼠体重已经稳步增加,与博莱霉素组比较有统计学意义(P<0.05)。2、肺系数第28天时,博莱霉素组和羧胺三唑组肺系数明显高于空白组(P<0.05),博莱霉素组肺系数最高,羧胺三唑组其次,羧胺三唑组小鼠肺系数与博莱霉素组比较有统计学意义(P<0.05)。3、小鼠生存分析28天死亡率由高到低依次为博莱霉素组(为50%)、羧胺三唑组(为30%)、空白组(无死亡)。空白组、博莱霉素组和羧胺三唑组在14天后生存曲线明显分开。4、第28天各组HE染色肺组织病理标本纤维化程度由重到轻依次为博莱霉素组、羧胺三唑组、空白组,空白组未见肺纤维化。将病理切片编秩,三组之间两两比较均有统计学意义(P<0.05)。5、Masson染色博莱霉素组和羧胺三唑组在实验第28天时,羧胺三唑组肺组织内的胶原沉积明显低于博莱霉素组。小鼠肺组织胶原染色后胶原纤维面积占视野肺组织面积的百分比三组之间两两比较均有统计学意义(P<0.05)。6、第28天时各组小鼠肺组织羟脯氨酸含量和肺组织匀浆中TGF-β1含量由高到低依次为博莱霉素组、羧胺三唑组和空白组。肺组织匀浆中IFN-γ含量依次为羧胺三唑组、博莱霉素组和空白组,且各组间两两比较有统计学意义(P<0.05)。28天时三组肺组织匀浆中MMP-9含量分别为空白组(325.560±34.210 ng/ml)、博莱霉素组(362.512±62.231ng/ml)和羧胺三唑组(349.751±45.391 ng/ml),组间两两比较无统计学意义(P>0.05)。第28天时三组肺组织匀浆中TIMP-1含量分别为空白组(72.824±5.530ng/ml)、博莱霉素组(369.250±57.508 ng/ml)和羧胺三唑组(246.208±20.572ng/ml),组间两两比较有统计学意义(P<0.05)。7、第28天时通过免疫组织化学的方法检测肺组织中TGF-β1、smad2和smad3的表达情况,以探讨羧胺三唑通过抑制TGF-β1/smad信号通路介导的致纤维化作用,进而起到抗纤维化的作用。空白组小鼠在肺组织中TGF-β1、smad2和smad3未见明显或见微弱表达,博莱霉素组中肺组织中见大量表达,羧胺三唑组肺组织中见表达明显减少。利用图像分析系统测定三组免疫组织化学切片阳性着色的灰度值,三组间两两比较有统计学意义(P<0.05)。8、第28天时通过Western blot方法检测肺组织中TGF-β1、smad2和smad3的表达量,小鼠TGF-β1蛋白表达趋势结果显示,与空白组比较,博莱霉素组和羧胺三唑组TGF-β1含量表达均有增加,羧胺三唑组较博莱霉素组明显减少,组间两两比较均有显著差异(P<0.05)。小鼠Smad2和Smad3蛋白表达趋势与TGF-β1相似,与空白组比较,博莱霉素组和羧胺三唑组Smad2和Smad3蛋白表达均有增加,羧胺三唑组较博莱霉素组明显减少,组间两两比较均有显著差异(P<0.05)。结论羧胺三唑可有效调控TGF-β/smad信号通路介导的致纤维化作用,羧胺三唑通过前者抑制TGF-β1、smad2及smad3在肺组织中的过度表达,调节肺组织匀浆中IFN-γ、TGF-β1、MMP-9和TIMP-1等细胞因子含量,进而有效改善模型小鼠肺泡炎症及肺纤维化程度。