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目的：肾癌是泌尿道最常见的恶性肿瘤之一,其向周围以及远隔器官侵袭转移是肾癌患者死亡的主要原因,目前肾癌向区域及脏器转移机制仍然不明。对肾癌转移机制的深层认识,从基因/分子水平找突破口是解决问题的一条途径。PRL属于一类新的PTP,PRL-3是PRL家族的一个成员。文献报道,PRL-3高表达与多种肿瘤的转移相关。而PRL-3高表达在肾癌领域尚无相关性报道。本课题的目的在于,构建携带有PRL-3特异miRNA的慢病毒载体,在肾癌细胞株上观察其沉默肾癌PRL-3基因后对肾癌细胞侵袭力与迁移力的影响,以此评价PRL-3基因在肾癌转移中的作用,从而为肾癌转移的后续治疗打下基础。
方法：利用Invitrogen公司miRNA网上设计工具,设计并合成3条PRL-3特异pre-miRNA-A,-B,-C;分别构建pcDNA.rPRL-3-miR-A,-B,-C表达质粒并转染人肾癌786-O细胞,RT-PCR和Western Blot检测沉默PRL-3基因效果；选择pcDNA.rPRL-3-miR-C质粒,经标准BP反应和标准LR反应构建重组质粒pLenti6/V5.rPRL-3miR-C,-neg(空载体);然后该重组质粒与包装质粒ViraPowerTMPackaging Mix按比例共转染293FT细胞包装重组慢病毒Lenti.rPRL3-miR-C,-neg(空载体)。以10倍为梯度用重组慢病毒感染786-O细胞,流式细胞仪检测病毒滴度。Blasticidin筛选感染重组慢病毒的786-0细胞,牙科探针在荧光显微镜下挑选荧光强度最高的细胞克隆；RT-PCR和Western Blot法检测沉默PRL-3基因效果。
将细胞分成3组：786-O(对照)组,Lenti.rPRL3-miR-C组和Lenti.rPRL3-miR-neg(空载体)组,每组8个复孔,分别培养于12孔板中,当细胞生长到融合度为95％时,以1 mL枪头作划痕试验,24小时后计算各组迁移到划痕区域的细胞数。将各组细胞在无血清RPMI-1640培养基中培养过夜,各组细胞在Transwell板上各取6个复孔,下室中加入完整培养基500μL,上室中加入含有1×105个细胞的无血清培养基100μL,24小时后用棉签去掉隔膜上表面的细胞,然后固定、复染,在100倍显微镜下挑5个不同视野计数隔膜下表面的细胞,计算细胞侵袭力。
结果：将pre-miRNA-A,-B,-C连接到表达质粒上即可得到重组质粒pcDNA.rPRL3-miR-A,-B,-C,测序表明,3个重组质粒的碱基序列均正确；RT-PCR和Western Blot结果显示pcDNA.rPRL3-miR-C质粒的沉默效果最显著。该质粒和空载体质粒进一步经BP和LR反应重组得到质粒pLenti6/V5.rPRL3-miR-C,-neg,测序表明,两个质粒的碱基序列都正确。将病毒上清加入786-O细胞后12小时后即可观察到绿色荧光产生证明慢病毒被成功包装；流式细胞仪检测得到浓缩后的重组慢病毒Lenti.rPRL3-miR-C滴度为2×106 TU/mL,空载体重组慢病毒Lenti.rPRL3-miR-neg的滴度为2.5×106 TU/mL。侵袭实验结果显示,侵过基质胶膜的细胞均数为：786-O组为109±23/HP;Lenti.rPRL3-miR-neg组为112±15/HP;Lenti.rPRL3-miR-C组为32±10/HP。统计分析表明：Lenti.rPRL3-miR-C组侵过基质胶膜细胞数明显少于其他两组(P＜0.05)。迁移力实验表明：786-O组的平均迁移能力为23±2.6 cells/mm2;Lenti.rPRL3-miR-neg组为20.8±1.9 cells/mm2;Lenti.rPRL3-miR-C组为5±1.6 cells/mm2。统计分析表明：相同面积下Lenti.rPRL3-miR-C组迁移到划痕中的细胞数明显少于其他两组(P<0.05)。
结论：人工设计的microRNA对目标基因具有更好的沉默效率,可满足基因功能的研究：重组慢病毒载体可为长时间的动物体内实验提供一个很好的解决方案；沉默PRL-3基因表达可显著减弱人肾癌786-O细胞的侵袭能力和迁移能力。可见PRL-3基因在肾癌细胞侵袭转移中起着关键作用,可作为治疗肾癌的一个潜在靶点。