血友病B是一种遗传性出血性疾病，它是由于血液中凝血因子Ⅸ（clotting factorⅨ，FⅨ）缺乏而导致的严重凝血功能障碍。血友病B在男性中发病率为三万分之一，表现为自发性出血性症状，严重者可因关节出血导致关节变形而残废。临床治疗血友病B主要靠蛋白替代治疗，即输血、凝血酶原复合物或补充FⅨ浓缩制剂。这样不仅价格昂贵，还可能引起严重输血反应；有一部分患者因反复输注而产生抗体，使再次接受含有FIX制品会极大降低其凝血功能和出现严重过敏反应,发生率可达50%；严重者还面临爱滋病及肝炎病毒感染的威胁。近年来开展的基因治疗技术有望成为一种根治血友病的有效手段。动物实验中显示了良好的前景，我国已开展了临床试验，均取得<WP=126>了良好疗效。基因治疗不同于传统的蛋白替代疗法，它试图给细胞提供一个健康的基因模板，以修补或替代功能缺陷的基因，从而使被遗传修饰的靶细胞成为特定的蛋白生产工厂，源源不断地为机体提供所需的蛋白，从根本上治愈疾病。由于FⅨ基因已经被克隆，且调控简单；基因转移的靶向性没有特殊要求，只要能通过血液循环到达全身即可；血友病B的基因治疗对蛋白的表达量没有严格要求，较低的表达水平就能够改善出血症状。当外源FⅨ的表达水平达到正常值的5%即有治疗效果，达到10%就能够消除血友病的症状。由于腺病毒(Adenovirus，Ad)载体在哺乳动物及其多种细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性，它具有①靶细胞种类多，导入效率高；②对增殖停止期细胞也有很高的导入效率，这是逆转录病毒载体所不具备的；③不整合到宿主基因组中，从而不会引起插入突变；④超离心可以制得高滴度1011PFU/ml以上病毒载体等诸多优点，因而在临床基因治疗领域也越来越受到重视。用于构建重组基因的腺病毒载体有两种：复制型和非复制型腺病毒。非复制型腺病毒确实了对于病毒复制所必需的病毒早期基因E1区，已知此区编码的多种蛋白（如E1A，E1B-19K和E1B-55K）与病毒的免疫逃逸机制有关。与复制型腺病毒相比，非复制型腺病毒更为安全。 <WP=127>考虑到传统方法构建重组腺病毒是一个相当费时的过程，我们采用了生长周期短、便于操作的大肠杆菌细胞内进行腺病毒骨架与克隆有外源基因的穿梭载体同源重组的新策略，显著提高了获得重组病毒的效率。在这一过程中，包括三个依次递进的步骤：将外源基因亚克隆于穿梭载体；重组穿梭载体与腺病毒骨架载体在大肠杆菌细胞内同源重组得到重组腺病毒DNA质粒；线性化重组腺病毒质粒转染293包装细胞得到重组腺病毒。通过这一路线，我们首次获得了人凝血因子Ⅸ基因非复制型重组腺病毒：AdEasyCMV-FⅨ。在用AdEasy系统构建重组腺病毒时，根据国内实验室的条件，我们对构建过程中的某些步骤进行了改进，使之更加简便、有效。①在转化及转染过程中，所用质粒均通过碱裂解法小量制备获得，这样就避免了使用CsCl超速离心、大提试剂盒或重组试剂盒等较为繁琐、费时、费资、且对实验设备有较高要求的制备及纯化质粒的方法，使重组腺病毒载体的构建工作在国内较普通的分子生物学实验室也能进行；②转化或转染前，对经碱裂解法小量制备的质粒在酶切消化后，借助常规的无水乙醇沉淀或透析袋电洗脱法回收、纯化，就完全可用于共转化或转染等操作步骤；③E.coli BJ5183为RecA +菌株，利于线性的穿梭质粒和环化的腺病毒骨架分子之间进行同源重组，从而获得重组腺病毒的质粒；但在E.coli BJ5183中质粒产量较低，难以获得高拷贝质粒进行转染操作。而用电穿孔转化法，可将重组腺病毒的<WP=128>质粒转化到能获得高拷贝的E.coli DH10B中，成功构建了pAdEasy-F.IX腺病毒重组质粒，经酶切和PCR鉴定正确,为细菌内同源重组的推广应用开避了另一途径。④方法简便、快捷,实验周期短。重组腺病毒质粒的同源重组在细菌内完成，从质粒转化BJ5183到重组克隆的出现只需要12～20d，对细菌内质粒DNA的抽提、酶切、鉴定远较哺乳动物细胞内DNA的抽提、鉴定容易.在进行体内免疫之前，我们对所得到的重组腺病毒的生物学特性进行了较为全面的研究。（1）：透射电镜观察到所得到的重组病毒直径约为70nm，具有较为典型的腺病毒形态，无其它微生物存在；（2）PCR及Southern blot鉴定表明重组腺病毒中，稳定地整合有F.Ⅸ基因；（3）Western blot实验中，重组腺病毒表达的F.Ⅸ蛋白可被F.Ⅸ抗体所特异性识别，分子量与天然人F.Ⅸ分子量相仿。血友病基因治疗目的之一就是hFIX产生达到治疗剂量并能长期表达，同时机体免疫系统不产生任何排斥反应。因此，只有通过适当的动物体内免疫学实验研究，才能判定转入的目的基因是否能长期表达；另外，我们设计产前经卵黄囊静脉输入免疫系统尚未发育完善的胎鼠体内这一途径，以进一步观察重复给与hFIX注射后免疫系统对外源性和转基因产物是否产生免疫耐受。本实验分三个阶段进行。第一阶段：产前基因治疗小鼠产后血清FIX及其抗体的表达；第二阶段： 产前<WP=129>基因治疗鼠对重复注射hFIX后免疫耐受情况观察；第三阶段：产前基因治疗的小鼠重复给与含AdhFIX腺病毒载体血清hFIX及其抗体的表达。本试验应用MF1小鼠，是由于这种小鼠?