中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis),因为其具有丰富的营养价值和广阔的市场需求,已成为我国十分重要的名特优水产养殖品种。然而,在池塘养殖过程中多种因素会导致其较高的肢体自切率,尤其是幼蟹(扣蟹)培育阶段。自切尽管可以带来短暂的生存机率,但也严重影响和制约着中华绒螯蟹的品质和经济效益。在我国,池塘养殖和稻蟹共养是中华绒螯蟹的主要养殖模式。在农业生产中拟除虫聚酯类农药(如溴氰菊酯)广泛使用,通过农田排水、地表径流等途径进入养殖水体,严重威胁着中华绒螯蟹的健康养殖。为了人为促进中华绒螯蟹的肢体再生、增强断肢蟹的免疫力和抗农药毒性,我们逐步探究了褪黑激素(MT)和其前体物质—L-色氨酸(L-trp)对中华绒螯蟹螯足再生、免疫性能和抗农药毒性的影响,以期为人工调控中华绒螯蟹的肢体再生和健康养殖探索新的道路。(1)自切后免疫水平的变化实验比较了自切和剪切左侧螯足短时间(3 h)内幼蟹的血液免疫水平的变化,结果发现:螯足自切后THC、GC、血清凝集能力和磷酸酶活性均显著增加(P<0.05),而HC和T-AOC在3 h内显著下降。此外,与自切组相比,剪切组3 h内的THC水平、凝集能力和血细胞增殖明显更高(P<0.05)。攻毒实验结果表明螯足自切死亡率显著增加,而剪切组的死亡率显著高于自切组。因此,本研究的观察结果表明,螯足自切显著降低了血液免疫和抗菌能力,而与剪切的被动创伤相比,自切作为一种先天性创伤反应机制,伤害更低、应激反应更灵敏迅速。(2)自切后血液转录组水平分析为探究中华绒螯蟹自切后血液分子免疫相关的重要功能基因,使用高通量测序技术比较分析了肢体健全、左侧螯足自切和双侧眼柄切除中华绒螯蟹的血细胞转录组数据。通过三组文库的多重比较获得共9 567个差异表达基因。通过KEGG富集分析,我们把三个文库中所得到的差异表达基因富集至344个特异KEGG代谢途径为了验证RNA-Seq鉴定的差异表达基因(DEGs)的表达水平,选择六种血细胞免疫相关基因进行qRT-PCR验证,qRT-PCR结果与DEGs结果一致。(3)螯足再生过程中芽体形态、生长相关基因表达和营养状况的变化结果发现新螯足在芽体中预先形成,然后随着中华绒螯蟹的蜕皮完成再生。第一次蜕皮后新足在形态上与正常螯足相似但尺寸较小。EcR和Chi的表达水平显著上调,而MIH的表达则显著下调(P<0.05)。另外,肝胰腺总脂含量在28 d内显著下降,自切组在14 d和21 d显著低于对照组(P<0.05)。自切组的SFA、HUFA和n-3/n-6在21 d显著高于对照组(P<0.05)。而自切组中1 d和7 d的Σn-6 PUFA和Σn-3 PUFA和28 d的MUFA显著低于对照组(P<0.05)。此外,ARA、EPA和DHA的水平表明自切组DHA在7 d显著降低,在21 d显著高于对照组(P<0.05)。而ARA和EPA在两组之间没有显著差异。自切组肌肉L-trp含量在1 d显著降低,7 d显著高于对照组(P<0.05)。这些结果表明,在螯足再生过程中,幼蟹可通过调节再生相关基因表达和营养代谢来加速蜕皮和再生。(4)MT对螯足再生、免疫和抗农药毒性的影响结果发现,注射MT显著提高了肢体再生速度(P<0.05)。EcR和Chi-mRNA表达水平显著上调,而MIH的表达显著下调(P<0.05)。MT显著改善肝胰腺脂肪酶活性(P<0.05)。另外,摘除单侧眼柄成活率显著下降,而摘除眼柄后再注射MT成活率显著得到改善(P<0.05)。MT显著增加血液免疫和抗氧化能力(P<0.05)。Del显著诱导肝胰腺线粒体的氧化应激和功能性损伤,如导致线粒体中MDA含量显著增加和GSH含量的显著下降;此外,线粒体ATP含量、Na~+-K~+-ATPase活性和Cyt-C含量显著下降,而且Del显著诱导血细胞凋亡。然而,MT预处理可以有效的防止Del对线粒体和血细胞造成的氧化损伤和功能损伤。因此,这些研究结果表明,MT不仅可以促进幼蟹螯足再生,还可以增强免疫并阻止Del造成的毒性伤害。(5)L-trp对螯足再生和免疫的影响饲料中添加L-trp显著提高了螯足再生速度(P<0.05)。EcR和Chi的表达显著上调,而MIH的表达显著下调(P<0.05)。消化酶活性显著改善(P<0.05)。此外,饲料中添加L-trp显著升高了眼柄中MT水平和肌肉中的L-trp水平(P<0.05)。有趣的是,我们的研究初步探讨了5-HT和DA相关受体在幼蟹螯足再生过程中的作用。结果发现饲料中添加L-trp可以调节消化器官(肝胰腺和肠道)和神经组织(胸脑神经节)中5-HT和DA相关受体的基因表达,我们推测它可能参与再生过程中消化吸收功能的改善和神经组织修复的调控。另外,统计14d的死亡率发现,饲料中添加L-trp显著降低了幼蟹的死亡率。此外,L-trp显著改善了血液免疫、抗氧化和抗菌能力。综上,饲料中添加L-trp不仅可以通过调节MT水平、5-HT和DA与相应受体的结合以促进中华绒螯蟹的螯足再生,同时还可以增强抗氧化能力、提高中华绒螯蟹在自切压力下的血液免疫状态和抗菌能力,从而提高断肢蟹的存活率。