目的：明确非杯状细胞和杯状细胞在兔结膜组织上的分布情况；探讨DispaseⅡ消化法原代培养兔结膜上皮细胞，观察其体外生长特性；确定兔结膜上皮细胞单克隆培养的条件、单克隆生长特征及不同部位结膜的克隆形成率。研究2型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus2，rAAV2)载体介导增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein，EGFP)对体外培养结膜上皮细胞的感染和表达情况，为结膜上皮干细胞的定位及rAAV-EGFP示踪结膜上皮干细胞的体内增殖分化研究提供依据；研究兔结膜上皮细胞单克隆在裸鼠皮下生长分化情况；检测并分选兔结膜上皮细胞SP细胞群（侧群干细胞side population cells），为进一步研究SP细胞群和结膜干细胞的关系奠定基础。　　 方法：制作兔结膜组织冰冻切片，行Pan-Keratin免疫荧光染色鉴定非杯状上皮细胞，PAS染色和MUC5AC免疫荧光染色鉴定杯状上皮细胞，观察非杯状上皮细胞和杯状上皮细胞在兔结膜组织上的分布情况。DispaseⅡ消化法原代培养兔结膜上皮细胞，观察不同时期细胞的生长情况、细胞形态、做免疫荧光及免疫组化染色鉴定，并比较不同部位结膜上皮细胞PCNA表达情况。rAAV2-EGFP按感染复数(multiplicity of infection，MOI)为103、104、105感染体外培养的第2代兔结膜上皮细胞，感染后第24h、48h、4d、6d、8d、10d倒置荧光显微镜下观察细胞中EGFP表达情况，流式细胞仪检测细胞EGFP表达阳性率，MTT方法检测rAAV2-EGFP转染对细胞增殖的影响。在饲细胞层上分别培养表达EGFP的兔眼睑结膜、穹隆部及球结膜上皮细胞单克隆，观察单克隆生长特性，比较三个部位结膜上皮细胞的克隆形成率，并做Pan-Keratin、MUC5AC、PCNA免疫组化鉴定。利用Hoechst33342染色，流式细胞仪检测并分选兔结膜上皮细胞SP细胞群。　　 结果：兔结膜的非杯状上皮细胞在睑结膜最厚约6～8层细胞，穹窿部结膜约3～5层细胞，球结膜较薄约1～3层，非杯状上皮细胞Pan-Keratin表达阳性，在结膜表明分布较为均匀；杯状上皮细胞MUC5AC表达阳性、PAS染色阳性，且在球结膜、穹窿部结膜和睑结膜，杯状上皮细胞是均匀分布的。DispaseⅡ消化法能够获得大量的较纯净的结膜上皮细胞，细胞生长增殖快，能传代4～5代，绝大多数细胞Pan-Keratin阳性，少数细胞MUC5AC表达阳性，兔睑结膜、穹隆部及球结膜上皮细胞PCNA表达阳性率下降，且存在差异。rAAV2-EGFP以MOI为103、104、105感染第2代兔结膜上皮细胞24h后，细胞出现EGFP表达，MOI越高，EGFP表达越强，转染效率越高，EGFP表达阳性的细胞在490nm波长激发光下发出绿色荧光，弥漫于整个胞浆。随着时间的延长，细胞中EGFP表达强度增强，EGFP阳性细胞数增加，转染后第7～8天表达达到高峰并维持，各MOI组转染率比较差异具有显著性，MOI为105组第8天感染效率高达41.2％。MTT检测各MOI组与对照组差别无显著性意义。兔结膜上皮细胞形成的单克隆具有多样性，单克隆PCNA染色部分细胞阳性，兔睑结膜上皮细胞具有较高的克隆形成率，与其它两个部位相比差别具有统计学意义。结膜上皮细胞中检测到了SP细胞群，并成功分选了SP细胞群，证实了SP细胞群在结膜上皮细胞中的比例约为2.11%～2.82%。　　 结论：(1)兔结膜的非杯状上皮细胞从睑结膜到球结膜层次依次变薄，杯状上皮细胞在球结膜、穹窿部结膜和睑结膜是均匀分布的。(2)DispaseⅡ消化法是进行体外结膜上皮细胞培养的理想方法。(3)rAAV2载体可以介导EGFP基因高效稳定转染结膜上皮细胞，并且对细胞增殖无影响。(4)兔眼睑结膜处可能存在结膜干细胞。(5)结膜上皮细胞中存在SP细胞群，比例约为2.11%～2.82%。