研究背景及目的:神经胶质细胞瘤,简称神经胶质瘤,起源于神经胶质细胞,是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,其中胶质母细胞瘤约占54%。胶质母细胞瘤具有较强的增殖、血管形成及迁移能力,对周围正常脑组织造成严重损害,生存期超过一年的患者仅为三分之一,而5年生存率只有5%。由于人们对其发病机制缺乏足够的了解。神经胶质瘤的早期诊断和五年生存率一直以来并没有明显提高。因此,深入研究神经胶质瘤发生、发展的分子机制,寻找新的肿瘤标志物和治疗靶点对神经胶质瘤的诊断与治疗具有重要意义。Hedgehog（Hh）信号通路是调控机体多种器官发育的重要信号通路,其主要成员包括Hh配体、膜受体Patched（PTCH）、跨膜蛋白Smoothened（Smo）以及胞浆蛋白Sufu等和通路末端锌指转录因子GLI家族（GLI1,GLI2,GLI3）。在生殖细胞中,影响Hh信号转导通路的突变往往伴随发育过程紊乱;而在体细胞中,激活Hh信号转导通路的突变往往伴随多种癌症的发生,如基底细胞癌、髓母细胞瘤、肺癌、乳腺癌、结肠癌和胶质母细胞瘤等恶性肿瘤中,Hh信号通路均有不同程度的异常活化。然而,异常活化的Hh信号通路参与肿瘤发生发展的分子机制尚有待进一步明晰。Hedgehog信号通路的功能主要是由转录因子GLI调控的靶基因介导。因此,为了寻找转录因子GLI新的靶基因并探索其在神经胶质瘤发展中的作用及其分子机制,本研究组分析了过表达活化的转录因子GLI2（GLI2A）的神经胶质瘤细胞的表达谱;筛选差异表达基因,并进行了后续研究,以期阐明Hh信号通路在神经胶质瘤发生发展中的作用及分子机制。实验方法与结果:一、神经胶质瘤细胞中受GLI2调控的基因的发掘方法:1.通过western blottingting检测了H4、U87和U118神经胶质瘤细胞中Hedgehog信号通路的核心组分,如PTCH1、Smo、Sufu、GLI1和GLI2等,以检测Hh信号通路在上述细胞中是否存在。2.通过慢病毒感染建立过表达活化型GLI2（GLI2A）的U87稳定细胞系及对照细胞系,并用芯片技术分析两组细胞的表达谱差异。3.选取在过表达GLI2A细胞中上调最显著的若干基因,通过Q-PCR实验进行验证,初步确定ARHGEF16基因为研究对象。4.在确定了GLI2对ARHGEF16基因表达的正调控作用之后,用软件（http://www.genomatix.de/）分析预测ARHGEF16基因启动子区的GLI结合位点,并克隆该位点构建荧光素酶报告基因质粒pGL3 basic-ARHGEF16-Luci。5.在过表达GLI2A的U87细胞中及对照细组胞中,同时转染pGL3basic-ARHGEF16-Luci质粒和pRL-TK参照质粒;经过48小时,用双荧光素酶报告基因实验分析GLI2对pGL3 basic-ARHGEF16-Luci的激活作用。6.通过染色质免疫共沉淀检测GLI2与ARHGEF16启动子区的结合作用。结果:1.Smo、PTCH1、GLI1、GLI2和Sufu在H4、U87和U118神经胶质瘤细胞系中都有表达,各组分的表达水平在不同细胞系之间存在差异。说明Hh信号通路存在于上述细胞中,并有可能参与调控神经胶质瘤细胞的生物学行为。2.芯片分析结果显示,与对照组相比,过表达GLI2A的U87细胞中的下调基因和上调基因分别为814个和1121个;经Q-PCR验证,初步选取在过表达GLI2A的U87细胞中显著上调的基因ARHGEF16进行进一步检测。在过表达GLI2A的H4、U87和U118细胞中,ARHGEF16基因的mRNA和蛋白水平显著上升;在H4细胞中干扰GLI2,或用GANT61抑制GLI2后,ARHGEF16基因的表达水平下降。3.在ARHGEF16基因启动子区及邻近区域-2500⁺2500（将ARHGEF16的mRNA NM₀14448.3的5‘端的第一个碱基记为+1）范围内,通过软件预测到9个候选的GBS（GBS1-9）,并将包含这9个位点的基因组分段,连接到pGL3 basic荧光素酶报告基因载体中,共构建3个报告基因质粒,分别命名为Frag-I,-II,-III。4.双荧光素酶报告基因实验显示GLI2能够显著激活Frag-I和Frag-III荧光素酶报告质粒;然而,当Frag-II的GBS2位点和Frag-III的GBS9位点突变后,Frag-I和Frag-III不能再被GLI2A激活,表明这两个位点在GLI转录激活ARHGEF16基因的过程中具有不可缺失的作用。5.与Normal rabbit IgG相比,在anti-GLI2组中,含有GBS2位点和GBS9位点的DNA片段被富集,而阴性对照基因组片段在Normal rabbit IgG和anti-GLI2组中的含量无差异,说明GLI2可以通过GBS2位点和GBS9位点结合ARHGEF16基因的启动子区。二、对ARHGEF16在神经胶质瘤细胞中的功能的研究方法:1.western blottingting实验结果显示,ARHGEF16基因表达水平在H4细胞中显著高于U87和U118,故通过慢病毒感染的方法用U87和U118神经胶质瘤细胞建立过表达ARHGEF16的稳定细胞系,用H4细胞建立干扰ARHGEF16的稳定细胞系。2.在过表达ARHGEF16的U87和U118稳定细胞系及对照细胞系中,通过Transwell实验和软琼脂克隆形成实验检测ARHGEF16对神经胶质瘤细胞迁移能力和增殖能力的影响;通过平板克隆实验检测干扰ARHGEF16的H4及对照细胞的增殖能力。3.在过表达GLI2A的U87稳定细胞系中干扰ARHGEF16,并通过Q-PCR和western blottingting确定干扰有效。然后通过Transwell迁移实验和软琼脂克隆形成实验检测Control+sh-Control,GLI2A+sh-Control和GLI2A+sh-ARHGEF16U87细胞的迁移能力和增殖能力,以表明GLI2A/ARHGEF16信号对神经胶质瘤细胞迁移能力和增值能力的影响。4.将U87 Control和U87 GLI2A神经胶质瘤细胞接种于裸小鼠皮下,待瘤体形成后,观测瘤体生长情况;接种细胞30天后,将小鼠处死并分离出瘤体,然后称量瘤体重量并通过免疫组化检测分析两组瘤体中的GLI2、ARHGEF16、Ki67（细胞增殖指标）和MMP9（细胞迁移指标）蛋白水平。结果:1.与对照组细胞相比,稳定过表达ARHGEF16时,有更多的U87和U118细胞穿过Transwell小室的膜而到达Transwell小室的另一侧;在软琼脂克隆形成实验中,过表达ARHGEF16的U87和U118细胞比对照组细胞形成更多更大的克隆,表明ARHGEF16能够增强U87和U118细胞的增殖能力。平板克隆结果显示,与对照组H4细胞相比,干扰ARHGEF16的H4细胞形成的克隆数显著减少。2.Transwell迁移实验和软琼脂克隆形成实验显示,GLI2A+sh-Control U87的迁移能力和增殖能力显著强于Control+sh-Control U87细胞,然而在干扰ARHGEF16后,GLI2A+sh-ARHGEF16 U87与GLI2A+sh-Control U87相比,其迁移能力和增殖能力显著降低,说明GLI2/ARHGEF16信号对神经胶质瘤细胞的迁移和增殖具有促进作用。3.与U87 Control相比,U87 GLI2A细胞形成的瘤体较大,并且瘤体中GLI2、ARHGEF16、Ki67和MMP9的蛋白水平显著升高。三、初步探索ARHGEF16促进神经胶质瘤细胞迁移和增殖的分子机制方法:1.将人的ARHGEF16蛋白与酵母转录因子GAL4的DNA结合结构域（DNA-binding domain,BD）形成的融合蛋白BD-ARHGEF16作为饵蛋白,通过酵母双杂交实验筛选与ARHGEF16相互作用的蛋白。2.通过免疫共沉淀和GST pull-down实验在神经胶质瘤细胞中验证ARHGEF16与筛选到的蛋白之间的相互作用。3.在过表达ARHGEF16的U87细胞中干扰CKAP5,然后通过Transwell迁移实验和软琼脂克隆形成实验检测Control+sh-Control,ARHGEF16+sh-Control和ARHGEF16+sh-CKAP5 U87细胞的迁移能力和增殖能力,以表明ARHGEF16与CKAP5共同作用而增强神经胶质瘤细胞迁移能力和增值能力。结果:1.在酵母双杂交系统筛选条件最严格的培养基SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA平板上形成的若干强阳性克隆中,经测序确定其中之一为CKAP5基因。2.免疫共沉淀和GST pull-down实验结果显示,CKAP5蛋白可以通过ARHGEF16而被特异性地富集,说明ARHGEF16与CKAP5之间有相互作用。3.Transwell迁移实验和软琼脂克隆形成实验显示,ARHGEF16+sh-Control U87的迁移能力和增殖能力显著强于Control+sh-Control U87细胞,然而在干扰CKAP5后,ARHGEF16+sh-CKAP5 U87与ARHGEF16+sh-Control U87相比,其迁移能力和增殖能力显著降低。结论:1.GLI2能够直接激活ARHGEF16转录。2.GLI2/ARHGEF16信号能促进神经胶质瘤细胞的迁移和增殖。3.ARHGEF16与CKAP5相互作用而介导GLI2诱导的神经胶质瘤细胞的迁移和增殖。