杆状病毒科(Baculoviridae)是一大类有囊膜包裹的双链环状DNA病毒，特异性感染包括鳞翅目(Lepidoptera)、膜翅目(Hymenoptera)和双翅目(Diptera)昆虫在内的节肢动物(Arthropoda)，因而是一种具有很高应用价值的病毒杀虫剂。野生型杆状病毒杀虫剂的杀虫速度较慢，对高龄幼虫施用剂量高，杀虫谱相对窄，由于这些缺点极大的限制了它的应用和推广。在遗传改良方面，尽管插入某些毒素基因如：蝎毒素基因可以显著提高杀虫速度，但在生物安全方面存在潜在风险。本文致力于通过干扰昆虫发育相关的激素基因，对棉铃虫病毒(HearNPV)进行遗传改良，为构建高效和安全的重组棉铃虫病毒杀虫剂提供理论基础。我们在HearNPV杆状病毒表达系统的基础上，将一段含有部分ptth(促前胸腺激素)和eh（羽化激素）基因的正反向重复序列插入HearNPV的基因组，拟通过RNAi的机制影响虫体蜕皮从而缩短杀虫时间。此外，为了实时追踪杆状病毒感染细胞的入侵、膜融合和出芽等关键过程，我们还分别构建了在病毒核衣壳上标记红色荧光蛋白mCherry以及在多角体包埋型病毒(ODV)的囊膜上标记量子点的两种重组病毒。最后，我们制备并筛选到了口服感染因子PIF3的4个单克隆抗体并确定了这4株单克隆抗体针对的2个抗原表位，为今后深入解析PIF3结构和功能的研究提供了重要材料。　　 第一章：文献综述。一共分为六个部分，第一部分介绍了杆状病毒的分类、形态结构以及病毒的感染及复制机理;第二部分介绍杆状病毒生物杀虫剂的研究应用现状以及杆状病毒遗传改良的主要方法及成效等;第三部分介绍RNAi技术的原理应用及棉铃虫ptth基因和eh基因的功能。第四部分介绍了目前常用的示踪活病毒的方法。第五部分介绍了口服感染因子PIF3的研究现状。第六部分介绍了本论文研究的内容及意义。　　 第二章：含有宿主ptth和eh基因dsRNA序列的重组棉铃虫病毒的构建。依据NCBI上的序列，利用RT-PCR从棉铃虫中分别扩增出ptth和eh基因的保守区域的片段，构建了含有ptth基因中的375 bp（全长681bp）和eh基因中的186bp（全长287bp）的正反向重复序列的RNAi转移载体，通过Bac-to-Bac系统转座到egtKO的HearNPV的基因组中，构建了含有ptth和eh基因dsRNA序列的重组病毒vHaBac-egtKO-ds RNA-polh。通过PCR鉴定，筛选到正确的重组子。提取重组的bacmid DNA，转染HzAM1细胞，获得重组病毒。将重组病毒BV注射4龄棉铃虫幼虫，获得vHaBac-dsRNA-polh病毒多角体。　　 第三章：具有示踪作用的重组杆状病毒的构建。为了追踪病毒感染细胞的过程，我们参考已发表的文献，将3个拷贝的mCherry分别与HearNPV和苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa carlifornica multiple nucleopolyhedorvirus，AcMNPV)的主要核衣壳蛋白VP39的C端融合，分别插入至HearNPV和AcMNPV的基因组中，命名为 vHaBac-Havp393mC-Hapolh和vAcBac-Acvp393mC-Acpolh。此外，利用ODV表面的特异性囊膜蛋白P74可以进行表面展示的特性，我们在HearNPV P74的N端插入一段可以特异性的结合生物素的AP（短肽受体， Accepter peptid），得到重组病毒vHaBac-p74AP-pOp166-BirA-Hapolh。在下一步的实验中，将利用AP可以结合生物素的特性，通过量子点标记的链霉素与生物素的特异性反应将量子点标记于P74蛋白上，并展示到ODV的囊膜表面。　　 第四章：PIF3单克隆抗体的筛选与抗原表位的鉴定。口服感染因子(PIFs)在杆状病毒口服感染过程中发挥非常重要的作用，目前口服感染因子的作用机制尚不清楚。目前，已有P74、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、PIF6七个PIFs被鉴定为ODV感染必需因子，它们中的一些在ODV表面以复合体(complex)形式才能在。其中，PIF3是PIF complex的核心成分之一，全长199个氨基酸，N端存在跨膜区，C端高度保守。为了进一步研究PIF3的结构与功能，本文用原核表达的PIF3蛋白免疫小鼠，利用杂交瘤技术筛选了4株单克隆抗体。在此基础上，我们构建一系列截短表达载体，用Western blot的方法鉴定到了这4株单克隆抗体针对的2个抗原表位。