利用饲喂法RNAi研究昆虫生长发育相关基因的功能

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通过dsRNA诱导的RNA干扰(RNAi)已经被广泛地用来研究昆虫基因的功能。特别是在近几年,通过饲喂dsRNA的方法已在多种昆虫中诱导靶标基因的沉默。然而,我们尚不知道通过喂食昆虫非中肠基因的dsRNA能否诱导产生有死亡表型的基因沉默,以及通过饲喂dsRNA的方式在刺吸式口器昆虫中是否同样有效?   本研究首先选取了鳞翅目夜蛾科昆虫甜菜夜蛾Spodoptera exigua为研究对象,克隆了一个与系统RNAi相关的重要分子基因片段。序列比对和系统分析表明,我们得到的这个基因片段为sid-1 like1基因的序列,由此说明甜菜夜蛾拥有sid-1 like基因并同时表明该昆虫存在系统RNAi的可能性。然后,选择在表皮和气管中表达但不在中肠表达的几丁质合成酶基因A(Se CHSA)作为靶标基因,通过饲喂甜菜夜蛾细菌HT115(DE3)表达dsRNA的方法将Se CHSA dsRNA(dsSeCHSA)导入幼虫体内,在持续饲喂dsRNA七天后发现靶标基因Se CHSA的转录水平被特异性地抑制,而且甜菜夜蛾幼虫的生长发育受到了明显的抑制并产生了蜕皮障碍等死亡表型。取食含有dsSeCHSA的饲料后,甜菜夜蛾四龄和五龄幼虫、预蛹和蛹的平均累计存活率分别为88.64%、74.24%、68.43%和62.63%;其中,五龄幼虫、预蛹和蛹的存活率显著低于3个对照组。研究结果还表明,通过取食细菌表达的dsRNA对靶标基因的转录水平、组织结构和昆虫存活率的影响均与dsRNA的浓度存在密切的关系。   为了研究饲喂dsRNA的方法在刺吸式口器昆虫中能否诱导靶标基因的沉默,我们又以褐飞虱Nilaparvata lugens为对象并选取了蜕皮激素受体基因NlEcR作为靶标基因。通过给褐飞虱饲喂NIEcR dsRNA的方式,发现在褐飞虱取食dsRNA两天后其目标基因的表达即有了明显的下降,在取食四天和六天时NIEcR的表达依然被抑制;目标基因表达水平的降低对褐飞虱的蜕皮、展翅等发育过程均产生了重要影响。从三龄若虫开始饲喂dsRNA两天、四天和六天后的平均存活率为61.81%、42.64%和21.39%;从四龄若虫开始饲喂dsRNA两天、四天和六天后平均存活率为74.92%、42.70%和15.87%;从五龄若虫开始饲喂dsRNA两天、四天和六天后的平均存活率则为75.89%、54.02%和36.61%。从三、四、五龄若虫开始独自饲喂dsRNA六天后,RNAi组与对照组之间的昆虫存活率均存在极显著的差异。然而,统计分析却发现从三、四、五龄不同龄期开始饲喂dsRNA与褐飞虱的死亡率之间没有明显的联系。   本论文的研究表明:1)通过饲喂dsRNA的方式可以在甜菜夜蛾和褐飞虱中诱导系统RNAi的产生;2)目标基因的沉默能够产生致死表型;3) SeCHSA和NlEcR基因分别在甜菜夜蛾与褐飞虱的发育过程之中起着重要的作用;4)干扰SeCHSA和NlEcR的表达有可能成为害虫控制的一种方式。
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