肝脏是人体最大的代谢和解毒器官,同时也是一个极为重要的免疫器官。血液流经肝脏时,带来大量的免疫细胞,以抵抗外来抗原的入侵。富含抗原的血液进入肝脏,通过肝窦网络,被一系列抗原提呈细胞和淋巴细胞所获取,启动复杂的免疫应答过程。揭示和探索肝脏内免疫网络调节将有利于建立调节肝脏损伤、纤维化和再生的策略,对治疗慢性肝病等具有重大意义。通常将具有两个或多于两个双键的脂肪酸称为多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs),多不饱和脂肪酸是人体必需脂肪酸,自身不能够合成,必需从外源食物中获得,根据其不饱和键的位置可分为n-6系和n-3系PUFAs。n-3系PUFAs多存在于植物和深海鱼类的体内,是指第一个不饱和键在从末端甲基开始数第三个C原子与第四个C原子之间的多不饱和脂肪酸,如亚麻酸、二十二碳六烯酸(docosahexenoic acid, DHA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)等都属于这一类。膳食脂肪酸构成比,尤其是n-6与n-3 PUFAs比值对血脂代谢及免疫功能有不同影响,其在体内对脂代谢和炎症反应的调控规律尚不清楚。肝脏作为机体脂类代谢的主要器官,游离的脂肪酸可大量循环至肝组织,因此, n-6/n-3 PUFAs比率必然会影响肝组织内免疫微环境,从而调控肝内的免疫防御和监视。在本文研究中,我们选用可将n-6 PUFAs内源性转化为n-3 PUFAs的一种过度表达fat-1基因的转基因小鼠作为动物模型,探讨n-3 PUFAs对肝组织损伤的调控作用,旨在为当前肝损伤疾病和慢性肝炎的临床辅助治疗提供新的视角。第一章N-3多不饱和脂肪酸对Con A诱导的自身免疫性肝损伤具有保护作用刀豆素A (Con A)诱导的免疫性肝损伤模型能较好地模拟人类肝脏自身免疫性疾病和病毒性肝炎的发病机制。通过给小鼠静脉注射Con A活化肝内T细胞可以建立肝脏损伤的实验动物模型,此模型呈现出急性肝炎的临床和病理组织学表现,包括肝脏中白细胞和淋巴细胞浸润、肝细胞坏死、血清转氨酶升高及炎性细胞因子分泌等。现今此模型己被广泛应用于研究T细胞介导的肝炎致病机制,从而形成了我们目前关于肝损伤过程的认识。富含n-3 PUFAs的鱼油已经作为处方药被广泛使用,其具有抗炎、调节血脂等健康益处,但是我们对鱼油的认识还远远不够,其中,n-3 PUFAs对T细胞介导的自身免疫性肝炎的调控作用也尚不清楚。目的：虽然目前已有大量关于肝脏损伤过程的研究,但是其中确切的细胞和分子机制还尚不清楚。越来越多的数据表明T细胞的活化在慢性肝脏损伤过程中具有相当重要的作用。在本章研究中,我们选用可将n-6 PUFAs内源性转化为n-3PUFAs的一种过度表达fat-1基因的转基因小鼠作为动物模型并给予Con A诱导小鼠急性肝损伤,探讨n-3 PUFAs对T细胞介导的自身免疫性肝炎的调控作用,旨在为当前临床肝炎的防治提供新的视角。方法：利用fat-1转基因小鼠建立Con A诱导肝组织损伤模型,研究内源性n-3 PUFAs对免疫性肝损伤的作用。(1)内源性n-3 PUFAs对Con A诱导小鼠肝损伤的影响WT小鼠和fat-1转基因小鼠经尾静脉按35 mg/kg体重注射Con A后观察小鼠的生存情况或按15 mg/kg体重注射Con A以诱导肝脏损伤。在不同的时间点收集血清并检测血清中GPT的活性,分离小鼠肝组织,利用HE染色方法观察肝组织病变,并利用TUNEL染色分析肝组织的坏死情况。(2)内源性n-3 PUFAs对Con A诱导小鼠肝内T细胞活化的免疫调控作用WT小鼠和fat-1转基因小鼠经尾静脉注射Con A后,分离小鼠肝内单个核细胞(mononuclear cells, MNCs),流式细胞术检测T细胞、NK细胞及NKT细胞的比例,检测CD69的表达状况,分析细胞的活化水平；Q-PCR分析肝组织中细胞因子(如：IFN-γ、TNF-α和IL-6等)的表达,分析T细胞亚群(T-bet、 GATA3、RORγt、Foxp3)转录因子的表达；ELISA方法检测不同时间点血清中细胞因子的表达水平；利用流式胞内细胞因子染色方法检测肝内分泌IFN-y的T细胞频数；免疫印迹方法检测肝组织中STAT1和STAT3的磷酸化水平。(3)体外实验分析n-3 PUFAs对T细胞活化的调节作用分离WT小鼠和fat-1转基因小鼠的肝单个核细胞,用不同剂量Con A(1、 2.5,5μg/ml)刺激72h,利用3H-TDR检测T细胞的增殖情况,收集24h和48h细胞培养上清,检测细胞因子IFN-y的表达水平；检测不同时间刺激后肝单个核细胞STAT1和STAT3的磷酸化水平。分离WT小鼠肝单个核细胞,CFSE染色标记细胞,用不同剂量Con A (1、2、 5μg/ml)或加入不同剂量的DHA (25、50.100μ mol/L)后刺激4d,检测T细胞的增殖情况,收集24h和48h细胞培养上清,检测细胞因子(如IL-2和IFN-y)的表达水平。结果： (1)WT小鼠较fat-1转基因小鼠更易诱导自身免疫性肝损伤,内源性n-3 PUFAs对Con A介导的肝组织损伤具有保护作用。静脉注射给予fat/1小鼠组及WT小鼠组致死剂量的ConA(35mg/kg/只)后,WT小鼠存活率显著低于fat-1转基因小鼠；另外,WT小鼠的肝损伤程度更重,凋亡或坏死细胞更多。(2)内源性n-3 PUFAs对Con A诱导的炎性细胞因子的分泌具有抑制作用Con A刺激后,WT小鼠较fat-1转基因小鼠表达更高水平的炎性细胞因子TNF-α、IL-6及IFN-γ、而IL-10在WT小鼠血清中的分泌则低于fat-1小鼠；此外,Th2型细胞因子IL-4和虽然在部分时间点分泌增多,但在两组小鼠中无统计学差异。肝脏mRNA水平检测结果与血清结果一致。(3)内源性n-3 PUFAs对Con A诱导的肝内T细胞活化具有抑制作用Con A注射后WT小鼠和fat-1小鼠肝组织中T细胞,NK细胞,NKT细胞在总的单个核细胞中所占比重并无差异,但是fat-1转基因小鼠肝组织中CD3+T细胞的活化程度显著低于野生型小鼠(CD69的表达水平)；同时,fat-1转基因小鼠肝组织中CD3+NK1.1+的NKT细胞及CD4+T细胞CD69的活化程度也显著低于野生型小鼠。(4)内源性n-3 PUFAs抑制Con A诱导的肝内T细胞分泌IFN-yCon A处理后,与WT小鼠相比fat-1小鼠肝脏中分泌IFN-y的CD4+T细胞比率较低。此外,Con A注射后fat-1小鼠肝脏组织中STAT1磷酸化水平要明显弱于相同处理的WT小鼠肝组织。同时,IL-6相关的信号通路STAT3磷酸化在两组小鼠肝组织中均有微弱的表达,且在6h时WT小鼠肝组织中STAT3磷酸化水平强于fat-1小鼠。(5)内源性n-3 PUFAs对Con A诱导的肝内Th1细胞亚群分化具有调节作用Con A处理后,WT小鼠肝脏中Th1细胞的转录因子T-bet的表达明显高于fat-1小鼠；而Th2细胞的转录因子GATA3表达在两组小鼠中没有明显差别；另外,与WT小鼠相比,Th17细胞的转录因子RORyt表达在fat-1小鼠中受到了抑制,相应地,Treg细胞的转录因子Foxp3在fat-1小鼠中表达升高。(6)fat-1转基因小鼠来源的肝MNCs对Con A刺激不敏感分离WT和fat-1转基因小鼠的肝MNCs,体外给予不同浓度的Con A刺激,结果显示,fat-1转基因小鼠来源的肝MNCs给予Con A刺激后增殖受到抑制,且分泌的细胞因子IFN-y也明显低于WT小鼠。fat-1小鼠来源的肝脏MNCs中STAT1和STAT3磷酸化水平要明显弱于相同处理的WT小鼠。(7)DHA可减弱WT小鼠肝MNCs对Con A刺激的反应分离WT小鼠肝MNCs,将其与不同浓度的DHA预先共培养4h,然后加入ConA刺激。CFSE增殖实验中,DHA可抑制Con A刺激的T细胞增殖以及细胞因子IFN-γ;和IL-2的分泌,并呈剂量依懒性。此外,DHA也可以抑制不同浓度的Con A刺激的T细胞分泌细胞因子IFN-y和IL-2。结论：体内外的n-3 PUFAs对T细胞的增殖、活化和炎性细胞因子的分泌均具有抑制作用,n-3 PUFAs亦可减缓自身免疫性疾病的病症。即n-3 PUFAs对Con A诱导的肝组织的损伤具有保护作用。这为临床自身免疫性肝炎的防治提供了新的视角。第二章N-3 PUFAs通过促进肝脏自噬水平参与自身免疫性肝损伤的调节自噬是细胞通过降解其自身的细胞质(器)来为生物合成提供可循环利用的原料,借此维持细胞内环境稳定和蛋白代谢平衡的过程。当细胞处于不利环境时,它是一种重要的自我保护机制,对维持细胞存活、避免凋亡有积极的作用。自噬在药物或免疫细胞活化引发肝损伤的过程中均增多,研究发现细胞自噬对肝损伤具有保护作用,但自噬在肝脏疾病中的作用机制尚有待深入研究；另外n-3 PUFAs可促进肝内细胞的自噬水平,但其在Con A诱导的自身免疫性肝损伤中的意义尚不明确。目的：研究WT和fαt-1转基因小鼠肝内细胞自噬水平对T细胞活化诱导肝组织损伤的调节作用,为通过调控自噬变化治疗肝脏疾病提供相关的实验依据。方法：(1)体内实验：WT小鼠和fat-1转基因小鼠给予Con A注射后,分离小鼠肝组织,免疫印迹技术检测自噬相关蛋白LC3和P62的变化,检测NF-κB信号的磷酸化水平；流式胞内染色分析小鼠肝脏T淋巴细胞内LC3的表达情况以及效应T细胞内NF-κB信号的磷酸化水平。(2)体外实验：分离WT小鼠及fat-1转基因小鼠肝内MNCs, Con A处理后,免疫印迹技术检测自噬相关蛋白LC3的变化；流式胞内染色分析小鼠肝脏T淋巴细胞内LC3的表达情况：分离WT小鼠肝MNCs,体外加入DHA共培养,Con A处理后,流式胞内染色分析细胞内LC3的表达情况。(3)WT小鼠和fαt-1转基因小鼠腹腔给予自噬抑制剂CQ后静脉注射Con A,检测血清转氨酶水平及观察小鼠肝脏的病理情况；分析血清细胞因子的分泌；T细胞的活化情况、T细胞内IFN-y的表达水平、肝组织中STAT1和STAT3的磷酸化水平等,具体方法参照上一章。结果：(1)在ConA诱导的肝损伤进程中,内源性n-3 PUFAs促进肝内自噬水平。WT小鼠和fat-1转基因小鼠给予Con A刺激后,肝内自噬标志物LC3表达上调,且fat-1转基因小鼠肝内LC3的表达水平较WT小鼠更高,与LC3的表达水平相对应的,fat-1转基因小鼠肝内P62的表达水平较低；fat-1转基因小鼠肝脏CD3+T细胞LC3的表达水平明显高于WT小鼠。体外将小鼠肝脏MNCs与Con A共培养后,fat-1转基因小鼠肝脏CD3+T细胞LC3的表达水平明显高于WT小鼠。(2)内源性n-3 PUFAs抑制肝内和T细胞内NF-κB信号的磷酸化WT小鼠和fat-1转基因小鼠给予Con A刺激后,fat-1小鼠肝脏中以及效应T细胞内NFκkB信号的磷酸化水平明显低于WT小鼠。(3)DHA可提高Con刺激的WT小鼠肝MNCs的自噬水平分离WT小鼠肝MNCs,预先加入DHA一组CD3+T细胞中LC3的表达水平明显高于对照组。(4)氯喹可阻断内源性n-3 PUFAs对Con A介导的肝组织损伤的保护作用fat-1转基因小鼠腹腔注射CQ 40 mg/kg, WT小鼠注射等体积的PBS,1h后两组小鼠尾静脉注射Con A 15 mg/kg,各时间点两组小鼠的GPT水平基本无差异；两组小鼠肝脏病理切片HE染色结果也显示损伤程度相似,基本无差别。(5)氯喹可阻断内源性n-3 PUFAs对自身免疫性肝炎小鼠炎性细胞因子的分泌及T细胞活化的抑制作用预先给fat-1转基因小鼠腹腔注射CQ 40 mg/kg, WT小鼠注射等体积的PBS,1h后两组小鼠尾静脉注射Con A 15 mg/kg,各时间点两组小鼠血清中TNF-a和IFN-y的水平基本无差异。WT小鼠和fαt-1小鼠肝组织中T细胞,NK细胞,NKT细胞在总的单个核细胞中所占比重无差异,两组小鼠肝组织中CD3+T细胞的活化程度以及CD3+NK1.1+的NKT细胞的活化程度(CD69的表达水平)均无明显差异。(6)氯喹可阻断内源性n-3 PUFAs对自身免疫性肝炎小鼠T细胞分泌IFN-γ的抑制作用预先给fat-1转基因小鼠腹腔注射CQ 40 mg/kg, WT小鼠注射等体积的PBS,1h后两组小鼠尾静脉注射Con A 15 mg/kg, WT和fat-1小鼠肝脏中分泌IFN-y的CD4+T细胞比率无明显差别。此外,用CQ阻断自噬后,两组小鼠肝脏组织中STAT1和STAT3磷酸化水平也基本相同。结论：在Con A诱导的肝损伤进程中,内源性n-3 PUFAs抑制肝内NF-κB信号的磷酸化,促进肝内自噬水平,fat-1转基因小鼠肝内自噬水平提高；用氯喹阻断自噬后,内源性n-3 PUFAs对Con A诱导的肝损伤的保护作用减弱或消失。即内源性n-3 PUFAs可能通过促进自噬来发挥对自身免疫性肝损伤的保护作用。综上,体内外的n-3 PUFAs对T细胞的增殖、活化和炎性细胞因子的分泌均具有抑制作用,n-3 PUFAs亦可减缓自身免疫性疾病的病症,其可能机制是促进了肝脏的自噬。即n-3 PUFAs可能通过促进自噬对Con A诱导的肝组织的损伤起到保护作用。这为临床自身免疫性肝炎的防治提供了新的视角。