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猪流感(Swine influenza,SI)是由猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)引起的猪的一种急性呼吸道传染病,各种类型的猪均可感染发病。其临床症状为突然发病,持续高热,精神沉郁,采食量下降或废绝,不同程度的呼吸道症状,并伴有流泪及鼻流黏液。SI的死亡率不高,病程结束后可迅速恢复,但是猪感染后不仅造成其生长速度下降、生产性能和经济效益降低,并极易继发其它疾病使病情加重甚至引起死亡。由于目前国内尚无猪流感病毒疫苗,因此对该病原的检测和遗传进化分析具有重要的意义。流感病毒属于正黏病毒科、单股负链RNA病毒,有8个独立的基因片段组成,分别编码其结构蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2)和非结构蛋白(NS1、NS2)。其中流感病毒的核蛋白是由NP基因编码,它作为流感病毒的特异性抗原,能够刺激宿主机体生产特异性的中和抗体,并且NP片段极度保守,突变率低,因此对流感病毒NP的研究有助于猪流感的免疫防控及诊断试剂和疫苗的研制。本实验通过以NP基因为靶标引物设计,克隆出NP基因片段,构建建立阳性质粒,优化了荧光定量PCR扩增条件。建立了一种能检测100拷贝、特异性和重复性良好的荧光定量检测方法。用该方法对从山东部分地区收集的各种类型的病料712份进行检测,同时进行普通PCR检测。结果表明荧光定量PCR检测出21份样品为阳性,阳性率2.9%,应用常规PCR对上述份病料进行检测,其中检测出10份样品,阳性率为1.4%。将全部检测阳性样品SPF鸡胚,结果分离得到1株具有血凝活性的流感病毒。通过对分离株进行全基因测序并对其同源性进行比较,结果发现该毒株的8个基因片段都与欧亚类禽H1N1相似,表明该分离株来源于欧亚类禽型H1N1猪源谱系。通过对该分离株的全基因进行序列分析,从分子水平上研究了该毒株的遗传进化,进一步丰富了山东地区猪流感的流行病学资料。