水稻中DEAD-box蛋白OsRH17功能研究显性抑制OsPMS1构建水稻突变体库

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PartⅠ:  RNA解旋酶是一类利用NTP水解释放的能量来解开RNA高级结构的酶。DEAD-box蛋白是RNA解旋酶中最大的亚家族,参与生物体的RNA代谢过程。水稻DEAD-box亚家族至少有58个成员,但该家族对水稻生长发育的影响及其机制尚不明了。本研究对水稻的一个DEAD-box蛋白OsRH17的功能进行了初步研究,获得以下主要研究结果:  1)利用稳定表达OsRH17与GFP的融合蛋白的水稻转基因植株的检测表明OsRH17蛋白定位于细胞核。  2)检测OsRH17基因的时空表达模式,结果表明该基因在愈伤组织和花器官中表达量较高,而在苗和根中表达极弱。进一步分析表明,OsRH17在花粉中表达最高;愈伤组织诱导分化过程中,该基因的表达量逐渐增加,在分化阶段的第10天达到高峰,随后逐渐降低。因此,OsRH17可能参与水稻的分化及雄配子体发育过程。  3)Real-Time PCR和半定量RT-PCR表明ABA能明显上调OsRH17的表达,IAA、GA、SA、NaCl、PEG和低温胁迫对OsRH17表达略微上调。用OsRH17启动子指导GUS表达证明ABA和NAA处理表达明显上调;低温、PEG、NaCl处理下表达略微上调;高温、KT、BA、SA处理下GUS的表达无显著变化,而2,4-D下调了GUS的表达。因此,OsRH17可能参与水稻的生长发育及抵御胁迫过程。  4)利用大肠杆菌原核表达系统检测OsRH17蛋白全长及其N端(N-1281)和C端(C-500)截短蛋白的功能,结果表明:转基因大肠杆菌只能表达少量的OsRH17蛋白以及N-1281,而不表达C-500蛋白;转基因大肠杆菌的生长速度从高到低为:转空载体对照>N-1281>OsRH17>C-500;此外,转基因大肠杆菌的成熟16SrRNA、23SrRNA和pre-23SrRNA前体表达量与对照基本一致,但是pre-16SrRNA前体的量明显积累。  5)毕赤酵母中表达OsRH17、N-128l和C-500,无论是胞内表达还是胞外分泌的OsRH17蛋白(或截短蛋白)对酵母菌的生长均无影响。  6)构建UBQ::OsRH17、UBQ::anti-OsRH17、UBQ::1281和UBQ::5004种重组载体并转化水稻植株,对转基因株系的苗期和成熟期的表型进行观察,结果表明转基因水稻的苗长、根长、株高、开花时间、穗长、主穗粒数及千粒重等与对照相比无明显差异;NaCl、ABA处理对转基因水稻亦无明显影响。  7)分析了转基因水稻中的rRNA表达情况,结果显示正常条件(1/2MS培养)和各种胁迫条件下(包括NaCl、高糖、低温、2,4-D、NAA和ABA),各转基因水稻中rRNA表达情况和野生型一致。  综上所述,OsRH17可影响大肠杆菌生长,但对酵母及水稻无影响。推测外源OsRH17可能与内源DEAD蛋白竞争,影响了大肠杆菌16SrRNA的成熟过程,从而抑制了大肠杆菌中核糖体合成。但是在酵母与水稻中,DEAD家族成员庞大,可能有其他的蛋白补偿了OsRH17的功能。  PartⅡ:  错配修复系统(mismatch repair,MMR)是存在于不同物种中维持基因组稳定的保守途径。拟南芥中,抑制MMR系统功能可造成大量的突变,从而获得不同表型的突变体,是一个极有前景的育种方式。在主要粮食作物中尚无使用该方法进行育种的报道。  OsPMS1基因水稻错配修复系统(MMR)的重要成分。本研究在籼稻品种“双丝香占”和粳稻品种“中花11”分别超表达该基因及其N端截短基因(OsPMS-136),对转基因水稻后代的表型观察表明:转基因水稻在萌发及生长阶段均出现大量的突变表型。首先,转基因水稻在萌发和幼苗阶段出现了大量的矮化和致死现象。其中,“双丝香占”矮化突变体为40%-44%,10%-14%的种子不萌发;“中花11”突变率相对较低,矮化个体比例为23%-30%,不萌发种子的比例为2%-6%。其次,转基因水稻的生长过程中也出现多种突变表型,涉及分蘖数、育性等。  通过ISSR检测表明,转基因株系的基因组序列发生了变异。对ISSR差异序列的序列分析表明,突变体中点突变以及微卫星序列不稳定性(microsatellite instability,MSI)发生频率高达2/kb,其中单核苷酸突变中,A:T→G:C突变占50%以上,暗示OsPMS1在错配修复系统主要参与修复单核苷酸突变中的A:T→G:C,并维持微卫星的稳定性。  转基因水稻后代出现多种重要的农艺性状的突变体,如大粒、耐盐、耐旱、不同的分蘖数及早花等。重要的是,这些突变体中的转基因可以被完全分离,从而获得具有突变表型的“非转基因”突变体。  综上所述,抑制MMR系统功能可创制水稻突变体,是一种有效的诱变育种方法,具有广阔的应用前景。
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