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表皮干细胞(keratinocyte stem cell,KSC)位于表皮基底层,具有强大的增殖潜能,可分化形成全层表皮,并具有产生皮肤附件的作用,是潜在的多能干细胞。由于表皮干细胞数量少,而且体外培养很容易分化,所以对培养KSC的生物学特性进行深入研究具有重要的意义。探究如何在体外培养获得足够数量的KSC用于研究及移植、如何在体内外诱导KSC定向分化是KSC研究的又一重要课题,解决这些问题的关键在于研究KSC增殖与分化的调控机制。 本室先期已对不同来源皮肤中的KSC的定位分布进行了研究,对KSC进行了初步的分离培养。本研究主要探讨分离纯化人KSC的方法,观察KSC在体外培养条件下的生长及分化特性。针对目的基因整合素β1(integrin β1)构建siRNA表达质粒并鉴定,探讨下调KSC中整合素β1的表达对KSC增殖与分化的影响。 将人表皮细胞接种在Ⅳ型胶原包被的培养瓶中粘附10min,取粘附的类KSC以低密度接种于滋养层上,培养14d后挑选KSC克隆分散培养,观察其克隆再形成率,通过免疫细胞荧光染色法检测培养KSC中intergin β1及involucrin的表达水平,分析其细胞周期。将一个KSC克隆的所有子代细胞消化后接种,连续传代,培养14d后计算克隆形成率(CFE),观察KSC子代细胞的总体分化情况。 针对目的基因integrin β1选择了两个RNAi作用靶点,构建到pSilencer3.1/H1-Hygro载体上,通过酶切及测序鉴定重组阳性质粒。将低密度接种的KSC克隆挑选出来分散后接种,待细胞长至60%左右汇合时转染,用不同比例脂质体转染试剂Dotap介导转染不同剂量报告基因EGFP,优化转染条件。重组阳性质粒转染人KSC,通过定量western blot、半定量RT-PCR检测对目的基因的抑制效率,筛选出最有效的RNAi作用靶点,将其重组质粒命名为siIntegrin β1。 重组质粒siImegrin β1转染人KSC48～72h后,提取细胞总蛋白及总RNA,通过定量western blot、半定量RT-PCR检测对目的基因的抑制效率;并对RNAi后KSC行细胞周期分析。挑选RNAi后48～72h的KSC克隆分散后接种于滋养层上,培养14d