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肝纤维化(hepatic fibrosis)是多种致病因素引起慢性肝病,进一步发展为肝硬化的一个共同病理途径。细胞外间质(extracellular matrix, ECM)的过度合成与异常沉积是其主要病理改变。肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)在肝纤维化的形成过程中发挥关键作用,它在正常情况下主要储存维生素A,合成少量胶原,而活化的HSC则转化为肌成纤维细胞,其自身增殖和胶原合成增加。在HSC中各种信号转导通路共同参与肝纤维化的形成,因此寻找新的信号转导通路对肝纤维化的形成机制进行系统研究,有助于对其发病机制更全面更深刻的理解。小鸟苷酸三磷酸酶(Rho GTPase)又称小G蛋白,是Ras超家族成员之一。它通过激活其下游靶分子—Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coilel coil forming protein kinase, ROCK),调节细胞的多种行为和功能,包括收缩、迁移、增殖及肿瘤细胞的转化和浸润等。Rho/ROCK信号转导通路的关键信号分子包括:Rho GTPase、ROCK和肌球蛋白磷酸酶(myosin phosphatase, MP)。Rho被多种外界刺激信号如溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)活化后,将活化信号传递给ROCK,ROCK接受Rho传递的活化信号,再依次将其底物MP结合亚单位第697位苏氨酸磷酸化而使之失活,失活的MP不能将肌球蛋白脱磷酸化,从而使胞浆内肌球蛋白轻链(myosin light chain, MLC)磷酸化水平升高,导致肌动-肌球蛋白交联增加,从而促进肌动蛋白微丝骨架的聚合,引起细胞的多种生物学行为。MP是一种肌球蛋白限制的特异的去磷酸化Thr-18、Ser-19的磷酸酶。由催化亚单位、调节亚单位(myosin binding subunit, MBS或myosin phosphatase target subunit 1, MYPT 1)和肌动蛋白结合亚单位组成。其调节亚单位接受Rho/ROCK的活化信号发生磷酸化,使MP失活。ROCK磷酸化MBS的位点可能有Thr695、Thr850和Ser854。细胞迁移是机体正常生长发育以及组织损伤、炎症反应必不可缺的生理过程。在肝组织修复及肝纤维化形成过程中,损伤局部大量HSC聚集可能与HSC定向迁移有关。有研究表明,小分子G蛋白Rho家族及其效应分子ROCKⅠ以多种方式参与细胞迁移的调节。LPA可以提高肝癌细胞的迁移和侵袭能力,而阻断Rho/ROCK通路可以抑制肝癌细胞的迁移和运动,说明肝癌细胞的侵袭被Rho途径推动。Y-27632,为一嘧啶衍生物,是近年来合成的ROCK特异性抑制剂,能够抑制ROCK介导的多种生物效应,它的合成极大地促进了Rho/ROCK通路的研究。迄今,Rho/ROCK信号通路在多种器官组织慢性炎性纤维化中的作用受到了日益广泛的关注,但在肝纤维化发生中的作用研究较少。而MP是该信号通路活化的一个标志性指标。为此,我们应用体外细胞培养技术,探讨Rho/ROCK信号通路特异性阻断剂Y-27632对大鼠HSC中MP磷酸化水平的抑制作用,从而为肝纤维化的发病机制和有效治疗提供理论依据。目的:探讨Rho/ROCK信号通路特异性阻断剂Y-27632对LPA刺激的大鼠HSC中MP磷酸化水平的抑制作用,以及该信号通路对HSC增殖、迁移的影响。方法:应用含2%胎牛血清、100 IU·mL-1青霉素、100μg·mL-1链霉素、4 mmol·L-1谷氨酰胺及1 mol·L-1 HEPES的RPMI 1640培养液,37℃、5%CO2条件下体外培养HSC。利用LPA诱导激活HSC后,以一定浓度的Y-27632阻断Rho/ROCK通路。采用Western blotting方法检测HSC中p-MYPT的蛋白表达;采用改良的Boyden双腔系统测定Y-27632对HSC迁移的抑制作用;采用MTT法等测定Y-27632对HSC的增殖抑制作用。结果:①Y-27632抑制HSC中MP磷酸化水平。Western blotting方法分析示:溶剂DMSO(二甲基亚枫)组p-MYPT表达较对照组无明显差异(P>0.05);LPA组p-MYPT表达明显较对照组增高,P<0.01;LPA+Y-27632组p-MYPT表达较对照组减少了45.76%(P<0.01)。Y-27632干预浓度越高,蛋白表达下降趋势越明显,呈剂量依赖性。用Y-27632干预LPA刺激的HSC,与0 h相比,Y-27632干预时间越长,p-MYPT表达下降趋势越明显,呈时间依赖性。②Y-27632抑制HSC的迁移。分别以10、30、50μmol·L-1不同浓度的Y27632与LPA作用于HSC,12 h后观察发现,30、50μmol·L-1浓度的Y27632作用组与单用LPA组比较,跨膜细胞数分别为21.10±1.87 vs 37.19±1.76、12.09±1.04 vs 37.19±1.76,均有统计学意义(P<0.01),且两浓度组间的差异有显著性(P<0.01),而10μmol·L-1浓度的Y27632作用组与单用LPA组比较无明显差异,说明随Y-27632浓度的增加,跨膜细胞数减少,迁移能力减弱。Y-27632干预LPA刺激的HSC,与0h组相比,Y-27632干预时间越长,跨膜细胞数下降趋势越明显。③Y-27632抑制HSC增殖。形态学观察:倒置显微镜下观察,新传代的HSC呈圆形,富含折光脂滴。接种1 h部分细胞开始黏着,4.5 h伸展,24 h细胞突起明显伸长、增多。随培养时间延长,细胞渐呈典型星状形态,突起多而长,并呈簇状生长。应用Y-27632干预HSC4 h后,HSC的星状或梭状突起开始回缩,逐渐变为缩水状的圆形细胞,细胞间隙增大,由致密状变为网格状,10 h开始有细胞脱落,48 h脱落细胞明显增多,悬浮于上清中,但细胞膜一直保持完整。细胞生长曲线:与0 h相比,Y-27632与LPA作用于HSC后12 h、24 h、48 h细胞的增殖抑制率分别为20.11%、42.48%、72.68%,呈时间依赖性。而单以相同浓度LPA作用于细胞,干预后12 h、24 h、48 h细胞生长增殖率分别为4.63%、10.37%和28.39%。表明Y-27632对HSC增殖有显著抑制作用。MTT法:Y-27632干预细胞12 h、24 h、48 h后,与对照组相比,LPA刺激细胞生长,3个时间点均有显著的统计学差异,P<0.01;各时间点的DMSO组与对照组比较无明显差异,P>0.05;各时间点的LPA+Y27632组与对照组相比细胞增殖明显受到抑制,均有显著的统计学差异,P<0.01。结论:Rho/ROCK信号通路特异性阻断剂Y-27632能够抑制LPA刺激的大鼠HSC中MP的磷酸化水平,并呈时间和剂量依赖性。特异性阻断Rho/ROCK信号通路能够抑制LPA刺激的HSC增殖、迁移。