脱氧核酶荧光探针用于细胞内microRNA的放大检测

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microRNA(miRNA)是一类小的单链非编码RNA,可以作为基因表达的关键控制因子,在多种生物过程中发挥重要作用。越来越多的研究表明,miRNA的异常表达与包括癌症在内的多种人类疾病密切相关。因此,发展高灵敏、高选择性的原位miRNA检测方法具有重要意义。迄今为止,已经开发了多种基于脱氧核酶的探针用于重要金属离子甚至生物分子的检测,因反应条件温和,脱氧核酶探针在细胞内核酸检测方面展示出了广阔的应用前景。本论文基于脱氧核酶发展了两种新型荧光探针用于活细胞内miRNA的放大检测,主要内容如下:(1)构建了一种基于金纳米颗粒的裂开型脱氧核酶用于细胞内miRNA-21的传感。该探针由金纳米颗粒和裂开型脱氧核酶及其底物组成。没有目标物时,裂开型脱氧核酶与其底物通过部分互补形成未激活的脱氧核酶motif,荧光基团被金纳米颗粒和猝灭基团猝灭。探针进入细胞后,miRNA-21会与脱氧核酶结合,在催化中心形成激活的二级结构,激活的脱氧核酶会将底物切断,荧光恢复。与此同时,被释放的目标物会与另一个未激活的脱氧核酶杂交开启下一轮的循环。在这过程中,少量的目标物即可触发并切割多条荧光基团标记的底物链,使其远离金纳米颗粒,荧光增强,实现miRNA-21的高灵敏检测。此外,实验结果表明探针可以快速地进入细胞,并能实现细胞内miRNA-21的成像。(2)发展了一种脱氧核酶级联放大体系用于细胞内miRNA-141的高灵敏检测。该体系由S1、S2、S3组成:S1是含有miRNA-141结合区域和下游引发链的上游发夹封闭型脱氧核酶链,S2是下游发夹封闭型脱氧核酶链,S3是两端分别标记荧光基团和猝灭基团的底物链。无目标物时,S1和S2通过分子内杂交形成发夹结构,使得脱氧核酶的催化活性被抑制,S3的荧光被猝灭基团猝灭。当靶标存在时首先会与上游脱氧核酶杂交,S1随即被激活,在镁离子的辅助下进行自切割,产生的切割片段能激活下游脱氧核酶。与此同时,被释放的miRNA-141会自动与其它的上游脱氧核酶杂交,开启下一轮的循环。被激活的下游脱氧核酶能切割多条底物链,实现信号的放大。实验结果表明,该体系可以极大地增强输出的荧光信号,并能实现活细胞内miRNA-141的成像。
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