论文部分内容阅读
目的：
骨质疏松（Osteoporosis）是一种以骨量减少和骨折易感性增加为特点的疾病。成骨细胞凋亡在骨骼发育和维持中起着至关重要的作用。氧化应激（Oxidativestress，OS）是由促氧化剂/抗氧化剂不平衡而导致的活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）的过量产生导致细胞结构及功能损伤的应激状态。研究证明，氧化应激介导的成骨细胞凋亡是各类骨质疏松发生的共同病理机制之一。因此，靶向调控氧化应激诱导的成骨细胞凋亡对于防治骨质疏松症具有重要意义。
线粒体是ROS的主要来源和攻击目标。线粒体功能障碍不但会影响成骨细胞的功能，同时还是氧化应激诱导的成骨细胞凋亡发生的分子基础。线粒体是高度动态的细胞器，处在频繁的融合与分裂。视神经萎缩1（Opticatrophy1,OPA1）是线粒体内膜融合所必需的关键分子，在线粒体动力学动态调控及功能维护中起着核心作用，且与细胞的凋亡发生密切相关，然而，OPA1介导的线粒体事件是否参与氧化应激诱导的成骨细胞凋亡，目前尚不清楚。
蛋白激酶B（ProteinkinaseB，AKT）作为关键调节剂在细胞存活和增殖的起重要作用。我们证实AKT在氧化应激状态下被快速激活，并导致Ser9处的糖原合成酶激酶3β（Glycogensynthasekinase3β，GSK3β）磷酸化。课题组前期证实该信号传导途径在调节氧化应激诱导的成骨细胞凋亡和线粒体功能障碍中起重要作用。而最新研究发现，依赖于OPA1的线粒体功能调节机制是由AKT-雷帕霉素靶蛋白（Mammaliantargetofrapamycin，mTOR）-核因子κB（Nuclearfactorkappa-B，NFκB）途径介导的。然而，氧化应激诱导的成骨细胞凋亡过程中，AKT-GSK3β是否介导OPA1而发挥作用，目前未见报道。
羟基酪醇（Hydroxytyrosol，HT）是橄榄油中具有卓越抗氧化性能的多酚化合物。动物实验证实其能有效抑制多核破骨细胞形成和促进成骨细胞中的钙沉积而发挥抗骨质疏松作用。然而，骨质疏松氧化应激病理状态下，羟基酪醇是否通过抑制氧化应激诱导的成骨细胞凋亡而维持成骨细胞活性，未见报道。研究揭示羟基酪醇醋酸盐通过磷脂酰肌醇激酶（Phosphatidylinositol3kinase，PI3K）/AKT信号传导途径直接靶向OPA1依赖的线粒体途径，以防止肌肉退化。那么羟基酪醇是否也同样靶向调控OPA1分裂和激活AKT-GSK3β信号传导途径对氧化应激诱导的成骨细胞凋亡发挥保护作用，目前未见报道。
因此，本研究的目的是探究（1）OPA1调节线粒体事件是否参与氧化应激诱导的成骨细胞凋亡;（2）羟基酪醇是否对氧化应激诱导的成骨细胞凋亡具有保护作用；（3）羟基酪醇发挥作用的确切分子机制。
方法：
取对数生长期小鼠前成骨细胞MC3T3-E1，随机分为以下几组：1）A：空白对照组，B：H2O2组；2）A：空白对照组，B：H2O2组，C：DMSO对照组，D：羟基酪醇对照组，E：羟基酪醇+H2O2组，F：抗氧化剂（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）对照组，G：NAC+H2O2组；3）A：空白对照组，B：H2O2组，C：羟基酪醇对照组，D：羟基酪醇+H2O2组，E：siRNA对照组，F：siRNAOPA1组，G：siRNA对照+H2O2组，H：siRNAOPA1+H2O2组，I：siRNA对照+H2O2+羟基酪醇组，J：siRNAOPA1+H2O2+羟基酪醇组；4）A：空白对照组，B：H2O2组，C：AKT抑制剂（2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-1(4H)-benzopyran-4-onehydrochloride，LY294002）对照组，D：LY294002+H2O2组，E：GSK3β抑制剂（4-benzyl-2-methyl-1,2,4-thiadiazolidine-3,5-dione，TDZD-8）对照组，F：TDZD-8+H2O2组，G：羟基酪醇对照组，H：羟基酪醇+H2O2组，I：羟基酪醇+LY294002对照组，J：羟基酪醇+LY294002+H2O2组。利用噻唑蓝（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT）法检测细胞活性。Annexin-V/PI双染实验及转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记（transferase-mediateddeoxyuridinetriphosphate-biotinnickendlabeling，TUNEL）染色检测凋亡情况。通过细胞线粒体荧光染色（MitoSOX）检测评价氧化应激水平。通过线粒体膜电位（Mitochondrialtransmembranepotential，MMP）检测及ATP水平检测评价线粒体功能状态。通过Mitotracker染色检测线粒体形态。分光光度计检测线粒体呼吸链复合物的酶活性。蛋白质印迹法（Westernblot）检测检测OPA1、p-AKT、p-GSKβ、AKT、GSKβ的变化。
结果：
1.H2O2呈浓度和时间依赖性地抑制成骨细胞活性。通过Annexin-V/PI双染实验、TUNEL染色结果发现H2O2诱导成骨细胞凋亡。H2O2处理后，成骨细胞线粒体ROS增加，线粒体膜电位下降，ATP水平下降。MitoTrackerRed染色显示H2O2处理后的MC3T3-E1细胞的线粒体碎片化，畸形，疱疹样和塌陷，线粒体长度更短，密度更低；
2.羟基酪醇预培养缓解了H2O2抑制的成骨细胞活性和细胞凋亡，并减少线粒体ROS、增加线粒体膜电位和ATP水平，线粒体长度和密度都有一定恢复。而抗氧化剂NAC预处理表现和羟基酪醇类似的保护作用；
3.H2O2导致了成骨细胞OPA1的分裂增加，表现为L-OPA1水平减少，S-OPA1水平增加，羟基酪醇预处理可减少OPA1的分裂。通过MTT检测和TUNEL染色结果可证明用OPA1siRNA预处理加剧H2O2对成骨细胞的活性抑制作用，细胞凋亡的发生。我们发现用OPA1siRNA转染MC3T3-E1细胞会加重线粒体形态异常和功能障碍，线粒体ROS产生显着增加和膜电位降低减少。此外，与对照细胞相比，用OPA1siRNA转染MC3T3-E1细胞明显降低了线粒体长度和密度。然而，羟基酪醇处理后在OPA1充足的情况下能恢复线粒体动力学和功能的破坏。相反，在用OPA1siRNA转染的细胞中，羟基酪的这些保护作用被显著消除。
4.H2O2抑制了成骨细胞AKT和GSK3β的磷酸化。GSK3β磷酸化水平在TDZD-8（GSK3β抑制剂）预处理下部分恢复，并且显著恢复了成骨细胞活性和减少细胞凋亡。而LY294002（AKT抑制剂）预处理使磷酸化AKT表达水平进一步降低，加剧了细胞活性的抑制作用和细胞凋亡的发生。此外，TDZD-8可部分恢复H2O2诱导的OPA1分裂增加和线粒体功能障碍。而LY294002预处理后加重OPA1分裂，线粒体功能障碍现象也进一步恶化。羟基酪醇预处理后可以显著恢复AKT活性，抑制了GSK3β的活性，并且抑制OPA1的分裂。而当羟基酪醇与LY294002以及H2O2一起处理成骨细胞时，LY294002部分抵消了羟基酪醇对AKT的激活以及对成骨细胞的保护作用。
结论：
1.H2O2诱导成骨细胞凋亡并伴发线粒体功能障碍。
2.OPA1介导线粒体碎裂导致H2O2诱发的成骨细胞凋亡。
3.羟基酪醇靶向抑制OPA1介导的线粒体碎裂化缓解H2O2诱导的成骨细胞凋亡。
4.羟基酪醇激活AKT-GSK3β信号阻止OPA1介导线粒体碎裂缓解成骨细胞凋亡。
骨质疏松（Osteoporosis）是一种以骨量减少和骨折易感性增加为特点的疾病。成骨细胞凋亡在骨骼发育和维持中起着至关重要的作用。氧化应激（Oxidativestress，OS）是由促氧化剂/抗氧化剂不平衡而导致的活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）的过量产生导致细胞结构及功能损伤的应激状态。研究证明，氧化应激介导的成骨细胞凋亡是各类骨质疏松发生的共同病理机制之一。因此，靶向调控氧化应激诱导的成骨细胞凋亡对于防治骨质疏松症具有重要意义。
线粒体是ROS的主要来源和攻击目标。线粒体功能障碍不但会影响成骨细胞的功能，同时还是氧化应激诱导的成骨细胞凋亡发生的分子基础。线粒体是高度动态的细胞器，处在频繁的融合与分裂。视神经萎缩1（Opticatrophy1,OPA1）是线粒体内膜融合所必需的关键分子，在线粒体动力学动态调控及功能维护中起着核心作用，且与细胞的凋亡发生密切相关，然而，OPA1介导的线粒体事件是否参与氧化应激诱导的成骨细胞凋亡，目前尚不清楚。
蛋白激酶B（ProteinkinaseB，AKT）作为关键调节剂在细胞存活和增殖的起重要作用。我们证实AKT在氧化应激状态下被快速激活，并导致Ser9处的糖原合成酶激酶3β（Glycogensynthasekinase3β，GSK3β）磷酸化。课题组前期证实该信号传导途径在调节氧化应激诱导的成骨细胞凋亡和线粒体功能障碍中起重要作用。而最新研究发现，依赖于OPA1的线粒体功能调节机制是由AKT-雷帕霉素靶蛋白（Mammaliantargetofrapamycin，mTOR）-核因子κB（Nuclearfactorkappa-B，NFκB）途径介导的。然而，氧化应激诱导的成骨细胞凋亡过程中，AKT-GSK3β是否介导OPA1而发挥作用，目前未见报道。
羟基酪醇（Hydroxytyrosol，HT）是橄榄油中具有卓越抗氧化性能的多酚化合物。动物实验证实其能有效抑制多核破骨细胞形成和促进成骨细胞中的钙沉积而发挥抗骨质疏松作用。然而，骨质疏松氧化应激病理状态下，羟基酪醇是否通过抑制氧化应激诱导的成骨细胞凋亡而维持成骨细胞活性，未见报道。研究揭示羟基酪醇醋酸盐通过磷脂酰肌醇激酶（Phosphatidylinositol3kinase，PI3K）/AKT信号传导途径直接靶向OPA1依赖的线粒体途径，以防止肌肉退化。那么羟基酪醇是否也同样靶向调控OPA1分裂和激活AKT-GSK3β信号传导途径对氧化应激诱导的成骨细胞凋亡发挥保护作用，目前未见报道。
因此，本研究的目的是探究（1）OPA1调节线粒体事件是否参与氧化应激诱导的成骨细胞凋亡;（2）羟基酪醇是否对氧化应激诱导的成骨细胞凋亡具有保护作用；（3）羟基酪醇发挥作用的确切分子机制。
方法：
取对数生长期小鼠前成骨细胞MC3T3-E1，随机分为以下几组：1）A：空白对照组，B：H2O2组；2）A：空白对照组，B：H2O2组，C：DMSO对照组，D：羟基酪醇对照组，E：羟基酪醇+H2O2组，F：抗氧化剂（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）对照组，G：NAC+H2O2组；3）A：空白对照组，B：H2O2组，C：羟基酪醇对照组，D：羟基酪醇+H2O2组，E：siRNA对照组，F：siRNAOPA1组，G：siRNA对照+H2O2组，H：siRNAOPA1+H2O2组，I：siRNA对照+H2O2+羟基酪醇组，J：siRNAOPA1+H2O2+羟基酪醇组；4）A：空白对照组，B：H2O2组，C：AKT抑制剂（2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-1(4H)-benzopyran-4-onehydrochloride，LY294002）对照组，D：LY294002+H2O2组，E：GSK3β抑制剂（4-benzyl-2-methyl-1,2,4-thiadiazolidine-3,5-dione，TDZD-8）对照组，F：TDZD-8+H2O2组，G：羟基酪醇对照组，H：羟基酪醇+H2O2组，I：羟基酪醇+LY294002对照组，J：羟基酪醇+LY294002+H2O2组。利用噻唑蓝（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT）法检测细胞活性。Annexin-V/PI双染实验及转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记（transferase-mediateddeoxyuridinetriphosphate-biotinnickendlabeling，TUNEL）染色检测凋亡情况。通过细胞线粒体荧光染色（MitoSOX）检测评价氧化应激水平。通过线粒体膜电位（Mitochondrialtransmembranepotential，MMP）检测及ATP水平检测评价线粒体功能状态。通过Mitotracker染色检测线粒体形态。分光光度计检测线粒体呼吸链复合物的酶活性。蛋白质印迹法（Westernblot）检测检测OPA1、p-AKT、p-GSKβ、AKT、GSKβ的变化。
结果：
1.H2O2呈浓度和时间依赖性地抑制成骨细胞活性。通过Annexin-V/PI双染实验、TUNEL染色结果发现H2O2诱导成骨细胞凋亡。H2O2处理后，成骨细胞线粒体ROS增加，线粒体膜电位下降，ATP水平下降。MitoTrackerRed染色显示H2O2处理后的MC3T3-E1细胞的线粒体碎片化，畸形，疱疹样和塌陷，线粒体长度更短，密度更低；
2.羟基酪醇预培养缓解了H2O2抑制的成骨细胞活性和细胞凋亡，并减少线粒体ROS、增加线粒体膜电位和ATP水平，线粒体长度和密度都有一定恢复。而抗氧化剂NAC预处理表现和羟基酪醇类似的保护作用；
3.H2O2导致了成骨细胞OPA1的分裂增加，表现为L-OPA1水平减少，S-OPA1水平增加，羟基酪醇预处理可减少OPA1的分裂。通过MTT检测和TUNEL染色结果可证明用OPA1siRNA预处理加剧H2O2对成骨细胞的活性抑制作用，细胞凋亡的发生。我们发现用OPA1siRNA转染MC3T3-E1细胞会加重线粒体形态异常和功能障碍，线粒体ROS产生显着增加和膜电位降低减少。此外，与对照细胞相比，用OPA1siRNA转染MC3T3-E1细胞明显降低了线粒体长度和密度。然而，羟基酪醇处理后在OPA1充足的情况下能恢复线粒体动力学和功能的破坏。相反，在用OPA1siRNA转染的细胞中，羟基酪的这些保护作用被显著消除。
4.H2O2抑制了成骨细胞AKT和GSK3β的磷酸化。GSK3β磷酸化水平在TDZD-8（GSK3β抑制剂）预处理下部分恢复，并且显著恢复了成骨细胞活性和减少细胞凋亡。而LY294002（AKT抑制剂）预处理使磷酸化AKT表达水平进一步降低，加剧了细胞活性的抑制作用和细胞凋亡的发生。此外，TDZD-8可部分恢复H2O2诱导的OPA1分裂增加和线粒体功能障碍。而LY294002预处理后加重OPA1分裂，线粒体功能障碍现象也进一步恶化。羟基酪醇预处理后可以显著恢复AKT活性，抑制了GSK3β的活性，并且抑制OPA1的分裂。而当羟基酪醇与LY294002以及H2O2一起处理成骨细胞时，LY294002部分抵消了羟基酪醇对AKT的激活以及对成骨细胞的保护作用。
结论：
1.H2O2诱导成骨细胞凋亡并伴发线粒体功能障碍。
2.OPA1介导线粒体碎裂导致H2O2诱发的成骨细胞凋亡。
3.羟基酪醇靶向抑制OPA1介导的线粒体碎裂化缓解H2O2诱导的成骨细胞凋亡。
4.羟基酪醇激活AKT-GSK3β信号阻止OPA1介导线粒体碎裂缓解成骨细胞凋亡。