弹状病毒是一类有包膜的负链RNA病毒。它的宿主范围很广，包括哺乳动物、鸟类、爬行动物、鱼类、昆虫和植物等，很多弹状病毒是动植物的重要病原，具有很强的致病性。鱼类弹状病毒是一种能使野生及家养鱼类产生严重疾病的病毒病原，给全球的鱼类养殖业造成了重大的经济损失。为了对弹状病毒有更深入的了解，对两种鱼类弹状病毒:大菱鲆弹状病毒(Scophthalmusmaximusrhabdovirus，SMRV)和牙鲆弹状病毒(Paralichthysolivaceusrhabdovirus，PORV)进行了基因组测序和分析。在获得PORV基因组全序列的基础上，利用反向遗传学技术对PORV进行了体外拯救，获得3个重组PORV(rPORV等)。主要研究内容和结果如下:　　 1、SMRV的基因组测序及基因分析。　　 根据已知的弹状病毒序列设计若干对简并引物，通过RT-PCR的方法扩增到四个片段，测序表明其主要位于M基因和L基因中。然后根据已测序列设计特异性引物，配合设计的简并引物扩增剩余未知的序列，同时利用3RACE和5RACE的方法来获得基因组两个末端的序列，最后得到了全长为11492个碱基的SMRV基因组全序列。SMRV的基因组编码五个典型的结构蛋白，排列顺序为3Leader-N-P-M-G-L-5Tailer。SMRV基因组两个末端的13个碱基完全反向互补。基因间隔区具有保守的CATGA7-CT-A(A/G)(C/G)A(A/G/T)序列结构，该序列与已知的所有弹状病毒间隔区序列有明显差异。氨基酸序列比对结果显示:SMRV的五个蛋白与其它鱼类弹状病毒的相应蛋白的相似性最高分别为N:34.2％（梭子鱼苗弹状病毒，PFRV），P:20.3％（金迪普拉病毒，CHPV），M:29.8％（鳜鱼弹状病毒，SCRV），G:44.2％（水泡性口炎病毒印第安株，VSNJV），L:48.9％(SCRV)。利用L基因保守区构建进化树，结果显示SMRV与水泡性口炎病毒属的病毒比较靠近。　　 对基因组序列进行分析，显示P基因里面存在一个小的ORF，称为Ps。通过对PsORF进行原核表达，制备抗体，然后进行western验证，结果显示在病毒感染的细胞中能检测到与Ps预计大小相似的明显的条带，表明PsORF在病毒感染过程中是表达的。通过亚细胞定位，表明Ps蛋白在细胞质中能形成圆环状的结构。Ps基因在已知的弹状病毒中未见报道。　　 2、PORV的基因组测序及分析。　　 根据测定SMRV全序列相同的方法获得了PORV的基因组序列。PORV基因组全长为11182个碱基，编码6个基因，按顺序排列依次为3LeaderN-P-M-G-NV-L-Tailer5。PORV基因组的组成与诺拉弹状病毒属的成员类似，但是比SMRV多一个NV基因。将PORV与已知的弹状病毒基于糖蛋白氨基酸序列构建的进化树显示PORV与诺拉弹状病毒属中的病毒性出血性败血症病毒(VHSV)聚为一支。将PORV与已知的VHSV病毒株基于六个基因氨基酸序列串联重排后的序列构建进化树以及氨基酸序列相似性比较结果都表明PORV与VHSV亚洲株中的韩国株较为接近。　　 3、利用反向遗传学技术鉴定PORV中NV基因的功能。　　 反向遗传学操作指由病毒的cDNA体外转录来拯救病毒的技术，是研究RNA病毒致病机制的有效方法。在获得PORV基因组的基础上，我们将含PORV基因组全长cDNA的转录质粒，与分别表达核蛋白、磷酸化蛋白和聚合酶蛋白的表达质粒共转染EPC细胞，拯救了与野生型PORV（wtPORV）仅有几个碱基差异的重组病毒(rPORV)。通过对rPORV诱导细胞病变的观察、RT-PCR及限制性酶切等实验来验证rPORV是否被成功拯救。我们进一步构建了另外两株重组病毒以用于对PORV非结构蛋白NV的功能研究:一株是将PORVcDNA中NV基因替换成绿色荧光蛋白(EGFP)基因，得到缺失NV基因的重组病毒株(rPORV-△NV-EGFP);另一株是通过在PORVcDNA中M和G基因之间插入一个EGFP基因得到的重组病毒(rPORV-EGFP)。rPORV-△NV-EGFP和rPORV-EGFP是否获得拯救，可直接通过绿色荧光的观察来判断。再通过测定wtPORV与重组病毒的生长曲线来比较它们复制能力的差异。结果显示，rPORV与rPORV-EGFP的生长曲线与wtPORV基本相同;而rPORV-△NV-EGFP的复制能力则显著低于wtPORV。NV基因的缺失的确导致的病毒复制能力的下降，表明NV对病毒的复制有影响。然而，rPORV-△NV-EGFP拯救成功，表明NV基因对于病毒的复制和拯救是非必须的。