目的:运用酵母双杂交技术研究Sedlin蛋白与PAM14蛋白的相互作用区域;构建PAM14蛋白及PAM14蛋白N端C端缺失突变体和Sedlin蛋白的真核表达载体,共同转染至COS7细胞,分别观察在哺乳动物细胞中的共定位情况;构建带HA标签的PAM14-N蛋白与带GFP标签的Sedlin蛋白共同转染至HEK293T细胞,进行免疫共沉淀,检测在哺乳动物细胞内Depp蛋白与Sedlin蛋白能否相互作用。构建Sedlin蛋白点突变体S30A,V130D到pcDGFP真核载体中转染到COS7细胞中观察单转定位情况与野生型的差别,分别再与带HA标签的PAM14缺失突变体蛋白共同转染至COS7细胞观察共定位情况。　　方法:以含人PAM14全长cDNA序列的质粒pACT2-PAM14为模板,用PCR方法扩增PAM14的cDNA序列,用限制性内切酶酶切PCR产物,回收目的片段,连接到酵母系统3提供的载体pGBKT7上,构建表达载体pGBKT7-PAM14。用相似的方法构建酵母系统载体pGBKT7-PAM14-N和pGBKT7-PAM14-C,真核表达载体 pCDNA3.1-PAM14-N-HA和 pCDNA3.1-HA-PAM14-C(N端254bp,编码84个AA,标记为PAM14-N)。　　把构建的酵母表达载体分组转化酵母感受态,检测它们相互作用的情况。pGADT7-Sedlin/pGBKT7,pGADT7-Sedlin/pGBKT7-PAM14 pGADT7-Sedlin/pGBKT7-PAM14-N,pGADT7-Sedlin/pGBKT7-PAM14-C pGADT7-Sedlin/pGBKT7-PAM14-N-N,pGADT7-Sedlin/pGBKT7-PAM14-N-C pGADT7-PAM14/pGBKT7-Sedlin(S30A) pGADT7-PAM14/pGBKT7-Sedlin(V130D) pGADT7-PAM14/pGBKT7-Sedlin(F83L) pGADT7-PAM14/pGBKT7-Sedlin(S73L)　　pGADT7-PAM14/pGBKT7-Sedlin(D47Y)把测序正确的酵母表达载体分组转化至酵母菌 AH109,在 SD/-Leu/-Trp/-His/+3-AT/X-α-gal盘上筛选蓝色的克隆。呈蓝色的克隆是α-gal活性为阳性的克隆。　　将构建正确的质粒pCDNA3.1-PAM14-N-HA/pCDGFP-Sedlin和pCDNA3.1–HA- PAM14/pCDGFP-Sedlin(S30A)分别转染COS7细胞,制作免疫荧光片,在荧光显微镜下观察它们在细胞内的定位。根据荧光片观察的结果分析,初步判断它们共定位于细胞核。将pCDNA3.1-PAM14-N-HA和pCDGFP-Sedlin共转染至HEK293T细胞,提取细胞裂解液,进行免疫共沉淀,后通过Western blot检测在哺乳动物细胞内PAM14-N蛋白与Sedlin蛋白能否结合。　　结果:经酶切和测序鉴定,各组质粒均构建正确。营养筛选及α-半乳糖苷酶活性的测定均表明PAM14-N和Sedlin能相互作用;pCDNA3.1-PAM14-N-HA和pCDGFP-Sedlin转染至COS7细胞中,免疫荧光显微镜观察PAM14-N和Sedlin共定位于细胞核区域;pCDNA3.1-HA-PAM14和pCDGFP-Sedlin(S30A)转染至COS7细胞中,免疫荧光显微镜观察PAM14和Sedlin(S30A)共定位于细胞核区域;免疫共沉淀还有待证明PAM14-N蛋白和Sedlin蛋白在HEK293T细胞中是否相互结合。　　结论:应用酵母双杂交系统3验证了Sedlin与PAM14-N之间的相互作用;PAM14氨基端的84个氨基酸残基对于Sedlin与PAM14的相互作用是必需的,并且氨基端的50个氨基酸是其与Sedlin相互作用的区域,Sedlin氨基端S30位氨基酸残基对于它们的相互作用不是必需的。