缺血/低氧损伤一直以来严重危害人类健康，其中脑卒中目前已成为世界范围内公认的第二大致死性疾病，具有较高的发病率、致残率和死亡率。虽然针对于脑卒中的治疗方法已有很多，但大部分都局限于溶栓和扩张血管等对症处理，尚缺乏系统有效的预防及治疗手段。近年来引起广泛关注的机体内源性保护现象——缺血/低氧预适应(Ischemic/hypoxic preconditioning，I/HPC)，即亚致死性缺血/低氧预刺激可诱发组织器官对继发严重缺血/低氧所致损伤产生耐受。该现象最初由美国学者Murry于1986年在狗心脏组织中发现，对其细胞信号转导机制的深入研究，可为临床防治脑卒中等缺血/低氧性疾病提供新思路。利用已建立小鼠整体HPC和细胞氧-糖剥夺(Oxygen-glucose deprivation，OGD)模型，我们以往多个研究已证实，随着低氧暴露次数的增加，小鼠低氧耐受时间明显延长，同时新奇型蛋白激酶Cε(novel protein kinase Cε，nPKCε)的膜转位水平（激活程度）在脑组织内明显增高，提示该蛋白可能参与了小鼠脑HPC的形成与发展过程。然而，nPKCε的激活是否介导了HPC对缺血小鼠脑皮层的保护作用仍然未知。并且，作为一种蛋白激酶，nPKCε发挥作用需要激活下游的多种底物蛋白或与其它蛋白发生相互作用。因此，本研究拟在已发现nPKCε参与小鼠脑HPC形成的基础上，借助蛋白质组学技术和生物信息学等鉴定和分析HPC小鼠脑皮层组织内与nPKCε相互作用的蛋白。并据此进一步利用大脑中动脉阻塞(Middlecerebral artery occlusion，MCAO)致缺血性脑卒中小鼠模型，借助蛋白免疫印迹和免疫组织化学等分子生物学技术，深入研究nPKCε和及其相互作用蛋白之一14-3-3γ在小鼠脑缺血/低氧损伤和适应中作用。所获成果可丰富人们对脑缺血/低氧损伤和适应机制的认识，并为临床防治脑卒中等缺血/低氧性疾病提供新的药物靶点。　　实验在室温20-22℃下进行，选用成年雄性BALB/c小鼠(12-14w,18-22g)，动物实验方法按照美国国立卫生研究院(NIH)制定的《实验动物饲养和使用》指南(NIH Publication No.80-23)进行。实验动物随机分为假手术(Sham)、缺血(Ischemia)、预适应后缺血(HPC+I)和抑制剂(HPC+I+εVl-2)共4组。按我室已建方法制备自然低氧诱导的小鼠整体HPC(低氧暴露4次)模型。低氧结束后1小时，再进行MCAO缺血模型的制备。手术后6小时取小数脑皮层，TTC染色分析脑梗死体积和水肿率。然后，收集皮层缺血核心区(Ischemia core，Ic)、半影区(Penumbra，P)和缺血对侧皮质(Contralateral，C)组织，提取胞浆和膜相关蛋白组分。应用蛋白印迹(Western blot)方法，观察不同脑区皮质组织内nPKCε膜转位水平及蛋白表达量变化的影响。部分小鼠冰冻切片，应用Nissl和TUNEL方法检测神经细胞的丢失和凋亡情况。进行蛋白质组学实验时，实验动物随机分为常氧对照(Con)及HPC组，低氧结束后立即断头处死小鼠，分离大脑皮层组织，提取胞浆及膜相关蛋白成分，利用nPKCε抗体进行免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)后，进行双向电泳(Two-dimensional electrophoresis，2-DE)分离。所得2-DE凝胶硝酸银染色后利用Image Master 2D Platinum软件进行图像分析。与对照组比较，选取HPC组小鼠大脑皮层内蛋白表达水平发生明显改变的点为目标蛋白点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-associated laser desorption Pionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)进行检测，获得的混合物肽片段质量指纹图谱用Swiss-prot数据库搜索进行蛋白鉴定，并应用GO(Gene ontology)数据库，根据分子功能及参与的生理过程的不同，将鉴定出的蛋白进行分类。最后应用Western blot，进一步验证HPC及MCAO小鼠脑内与nPKCε相互作用蛋白14-3-3γ的差异表达情况。实验数据使用单一因素方差分析(One way ANOVA)和Bonferroni检验进行统计学处理，以均数±标准误(X±S.E.)表示，其中p＜0.05为差异显著。　　实验结果如下:　　1.HPC可明显抑制皮层缺血半影区nPKCε膜转位的降低　　Western blot结果显示，缺血6小时后单纯缺血组小鼠皮层缺血核心区和半影区内nPKCε膜转位水平与假手术组相比明显下降，而HPC缺血组小鼠皮层半影区内nPKCε膜转位水平与单纯缺血组相比明显增高(p＜0.05，n=6)。提示，HPC可能通过增高nPKCε膜转位水平对小鼠缺血脑组织起保护作用。　　2.抑制nPKCε的激活可取消HPC对缺血脑的保护作用　　借助SDS-PAGE和Western blot发现，HPC可明显缓解半影区MCAO所致nPKCε膜转位水平的降低，侧脑室注射nPKCε特异性抑制剂εV1-2可明显抑制HPC+I小鼠皮层缺血区和半影区组织内nPKCε膜转位水平的降低(p＜0.05，n=6)。　　利用TTC染色发现，MCAO处理可导致明显的小鼠局灶性脑缺血及明显的水肿。HPC能够明显地降低MCAO所致的局灶性脑梗死和水肿率，而侧脑室注射nPKCε特异性抑制剂εV1-2(5nM，5mL)可取消HPC的保护作用(p＜0.05，n=10)。　　利用TUNEL法检测皮层缺血半影区中神经细胞的凋亡情况发现，缺血组小鼠皮层半影区内可检测到一定程度的神经细胞凋亡，而HPC可使半影区凋亡细胞数明显减少，侧脑室注射nPKCε特异性抑制剂εV1-2干预则取消了HPC的保护作用(p＜0.05，n=3)。　　Nissl染色结果显示，缺血损伤可致小鼠皮层缺血半影区神经元数目明显减少，且细胞形态发生明显变化，细胞固缩，边缘不完整，细胞碎片较多。HPC可明显缓解缺血所致的神经元损伤，细胞形态较好，染色均匀，而侧脑室注射εV1-2也可取消HPC的保护作用(p＜0.05，n=3)。　　3.HPC小鼠大脑皮层组织内nPKCε相互作用蛋白蛋白质组学分析　　在对照组和HPC组小鼠皮层胞浆和膜相关蛋白成分中均可检测到与nPKCε相互作用的蛋白点，且重复性较好。将对照组和HPC组小鼠大脑皮层组织内nPKCε相互作用蛋白2-DE图谱进行硝酸银染色后，利用ImageMaster2D Platinum软件进行图像分析比较，目标蛋白点利用MALDI-TOF-MS进行检测，并通过Swiss-prot数据库搜索鉴定后发现，在HPC小鼠大大脑皮层胞浆成分中鉴定出的15个蛋白中有3个上调(14-3-3γ，磷酸丙糖异构酶，热休克蛋白71)，1个下调（三磷酸甘油醛脱氢酶）;膜相关成分中鉴定出的24个蛋白中有5个上调(三磷酸甘油醛脱氢酶，热休克蛋白60，热休克蛋白71，78KD葡萄糖调节蛋白前体，14-3-3γ)，2个下调（转录激活因子PURA，乌头酸水解酶）。　　4.差异表达的nPKCε相互作用蛋白生物信息学分析　　利用生物信息学，我们对已鉴定出的39个小鼠脑皮层内与nPKCε相互作用蛋白进行分析，GO数据库功能注释结果提示，nPKCε可能与39个相互作用蛋白相互作用参与了57个生物学及代谢过程。同时，在25个有显著性意义的GO功能分类中，包括了5个在低氧预适应过程中发生明显变化的蛋白，它们分别是aconitate hydratase(Aco2), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(Gapdh), heat-shockcognate 71 kDa protein(Hspa8), triosephosphate isomerase(Tpil)及14-3-3 protein gamma(Ywhag)。其中，在低氧预适应发生发展过程中，小鼠脑皮层胞浆和膜相关成分内均明显升高的14-3-3γ参与了以下生物学过程:intracellular protein transport(GO:0006886), intracellular transport(GO:0046907), intracellular cellular protein localization(GO:0034613) and transport cellular macromolecule localization(GO:0070727).　　5.HPC增强小鼠脑皮层内nPKCε与14-3-3γ的相互作用　　利用免疫共沉淀沉淀及Western blot，进一步验证了14-3-3γ与nPKCε确实存在相互作用，这个结果与双向电泳的分析结果一致。并且HPC可致小鼠缺血脑皮层核心区及半影区内与nPKCε相互作用的14-3-3γ蛋白量升高(p＜0.05，n=3)。　　综上所述，本课题在已利用整体小鼠低氧模型及细胞OGD模型证实nPKCε的膜转位激活参与了HPC的发生发展过程基础上，进一步利用整体小鼠HPC模型和MCAO模型，借助蛋白质组学技术鉴定HPC小鼠脑皮层组织内与nPKCε相互作用的蛋白。并借助蛋白免疫印迹、免疫组织化学及免疫共沉淀等多种分子生物学技术，系统探讨nPKCε及其相互作用蛋白14-3-3γ在小鼠脑缺血/低氧损伤和适应中的作用。