胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）是肥胖和代谢综合征的重要特征之一,其发病机制复杂,与机体内质网应激、肠道菌群紊乱、炎症等相关,其中慢性低度炎症被认为是胰岛素抵抗发生的一个关键因素。胰岛素由胰岛β细胞分泌,经胰岛素信号通路发挥生物学效应。当机体内发生低度炎症时,炎症信号通路被激活,可干扰胰岛素及其信号通路的信号分子发挥正常效应,导致糖脂代谢失调,最终促使胰岛素抵抗。低度炎症的发生与Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）密切相关。TLR2属于TLRs家族中重要的一员,TLR2不仅可以识别细菌的脂蛋白、细胞壁等组分,还可以和体内的脂肪酸结合引起炎症反应,使胰岛素敏感性减低。巨噬细胞参与脂肪、肝脏和肌肉组织的低度炎症反应,被认为是炎症诱导胰岛素抵抗的诱发因素。当巨噬细胞应对不同的微环境时,可被极化为促炎-M1表型和抗炎-M2表型。TLR2于巨噬细胞表达丰富,有研究发现,TLR2信号可影响巨噬细胞极化过程。那么,TLR2参与胰岛素抵抗是否与TLR2调节巨噬细胞的极化、进而调节胰岛素抵抗有关呢?目前尚无报道。因此,本研究采用TLR2基因敲除(TLR2 knock out,TLR2^-/-)与野生型（Wild type,WT）雄性C57BL/6小鼠进行体内研究实验,以RAW264.7巨噬细胞和3T3-L1脂肪细胞进行体外研究实验,探讨TLR2通过影响巨噬细胞极化降低胰岛素敏感性的科学假说,以进一步丰富胰岛素抵抗的分子机制,为寻找肥胖和2型糖尿病预防和治疗的新靶点提供实验依据和理论基础。实验时,我们首先进行了TLR2^-/-小鼠和WT小鼠基因型的验证以保证实验的严谨性和可靠性。结果显示,12只TLR2^-/-小鼠均无TLR2基因的特异性扩增条带,而12只WT小鼠有TLR2基因的特异性扩增条带。为了证明TLR2与胰岛素抵抗的相关性,对TLR2^-/-小鼠和WT小鼠分别在幼年和成年时期,进行了葡萄糖耐量实验（glucose tolerance test,GTT）和胰岛素抵抗实验（insulin resistance test,ITT）,结果显示,无论是在幼年还是成年时期,与WT小鼠比较,TLR2^-/-小鼠的葡萄糖利用率均增加,胰岛素敏感性均增强,提示TLR2基因缺失能改善小鼠对葡萄糖的调节能力、提高胰岛素的敏感性。为判断TLR2信号是否影响小鼠巨噬细胞极化表型、了解小鼠体内巨噬细胞的极化情况,从小鼠眼内眦静脉进行采血,用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,然后以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）联合γ-干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）和脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）以及巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor,M-CSF）联合白细胞介素-4（interleukin 4,IL-4）和IL-13分别诱导PBMC,诱导其向M1型巨噬细胞或M2型巨噬细胞极化,通过流式细胞仪检测M1型和M2型巨噬细胞的标志物和通过酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）实验检测细胞因子的表达量确定巨噬细胞表型。结果发现,与WT小鼠比较,无论在幼年期还是成年期,TLR2^-/-小鼠M1型巨噬细胞的平均荧光强度（mean fluorescence intensity,MFI）均降低,促炎因子IL-6和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）也均降低;而M2型巨噬细胞MFI均增高,抗炎因子IL-10表达量增加,差别有统计学意义（P<0.05）。进一步,针对小鼠又进行了高脂饮食诱导。TLR2^-/-与WT小鼠各随机分为两组,每组6只,分为TLR2^-/-小鼠高脂饲料（high-fat diet,HFD）组、TLR2^-/-小鼠基础饲料（normal diet,ND）组、WT小鼠高脂饲料组和WT小鼠基础饲料组。喂养到19周,每组小鼠均行GTT和ITT实验。结果显示,高脂饲料与基础饲料喂养的TLR2^-/-小鼠比对,GTT和ITT结果均无明显差异;而高脂饮食与基础饲料喂养的WT小鼠比对,GTT和ITT结果均差异明显,对葡糖糖的利用率和胰岛素敏感性均降低（P<0.05）。GTT和ITT结果提示TLR2参与了胰岛素抵抗的发生,抑制TLR2表达可防止由高脂饮食诱导的胰岛素抵抗。四组小鼠的巨噬细胞极化实验结果显示,TLR2^-/-小鼠巨噬细胞的极化状态不受高脂饮食诱导的影响,与基础饲料喂养的TLR2基因敲除小鼠巨噬细胞的极化状态无差异。相反,WT小鼠则表现为M1型巨噬细胞极化增强,且在高脂饮食诱导下,M1型极化更明显,促炎因子分泌更多。提示TLR2基因缺失可抑制由高脂诱导的巨噬细胞向M1表型极化。另外,小鼠体内实验还显示,在高脂饮食诱导下,TLR2^-/-小鼠的体重和腹部脂肪量显著低于WT小鼠,提示TLR2介导M1巨噬细胞极化,可能参与了体内脂肪的积累,使体重增加。以上小鼠体内实验认为,巨噬细胞极化可能是TLR2基因促进胰岛素抵抗发生的关键。为了验证上述结论,我们又进行了体外细胞学实验,采用RAW264.7巨噬细胞和3T3-L1脂肪细胞,用软脂酸（palmitic acid,PA）对RAW264.7细胞进行高脂饮食模型诱导,用TLR2激动剂-三酰脂肽（Pam3CSK4）和TLR2抑制剂（C29）,从正反两方面探讨TLR2对巨噬细胞极化的影响及其对脂肪组织胰岛素敏感性的影响。RAW264.7巨噬细胞极化实验显示,RAW264.7巨噬细胞在TLR2抑制剂的诱导下,M2型极化增加、抗炎因子IL-10分泌增多,且当TLR2抑制剂和软脂酸共同诱导时,依然表现为M2型极化增加、抗炎因子IL-10分泌越多;在TLR2激动剂作用下,细胞向M2型极化减低,而向M1型极化增多,促炎细胞因子IL-6和TNF-α分泌增多,且当TLR2激动剂和软脂酸共同作用时,M2表型极化降低更显著。提示,TLR2基因缺失可抑制巨噬细胞向M1表型极化,并且可抑制软脂酸诱导巨噬细胞向M1表型极化。3T3-L1脂肪细胞和RAW264.7巨噬细胞共培养后,再经TLR2激动剂诱导,3T3-L1脂肪细胞分泌的单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）显著升高;而再经TLR2抑制剂诱导,3T3-L1脂肪细胞分泌的MCP-1则显著减低;且TLR2抑制剂单独诱导和TLR2抑制剂联合软脂酸共同诱导时,脂肪细胞分泌的MCP-1无显著差异,说明TLR2信号缺失可抑制因脂肪酸诱导导致的脂肪细胞MCP-1的分泌,从而抑制M1巨噬细胞浸润脂肪细胞。3T3-L1脂肪细胞消耗葡萄糖的实验结果显示,3T3-L1脂肪细胞和RAW264.7巨噬细胞单独培养时,经胰岛素刺激,无论有无TLR2激动剂或抑制剂诱导,二者对葡萄糖的消耗率均无明显变化;但是当3T3-L1脂肪细胞用极化为M1表型的RAW264.7巨噬细胞培养液进行培养时,再在TLR2激动剂诱导下,3T3-L1细胞对葡萄糖的消耗率降低,而在TLR2抑制剂诱导下,3T3-L1细胞对葡萄糖的消耗率增高,且在TLR2抑制剂和软脂酸共同诱导下,3T3-L1细胞对葡萄糖的消耗率与单独TLR2抑制剂诱导时相同。说明,在有极化为M1表型的RAW264.7巨噬细胞参与下,TLR2激动剂使3T3-L1细胞对胰岛素的敏感性降低,而抑制剂则使3T3-L1细胞对胰岛素的敏感性提高,提示,TLR2使脂肪细胞对胰岛素的敏感性降低,需M1型巨噬细胞协同。采用生物信息学技术检索TLR2信号通路与胰岛素信号通路,分析两条信号通路交联情况。结果显示,在胰岛素信号通路和TLR2信号通路存在交互作用,发现胰岛素受体底物（insulin receptor substrate,IRS）与c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）、蛋白激酶（protein kinase,Akt）与核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）、IRS与NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB,IκB）激酶（IκB kinase,IKK）、Ras相关C3肉毒毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1）与磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K）可直接或间接相互作用,从而影响胰岛素代谢。综上,体内实验和体外实验揭示,TLR2信号被激活后可影响巨噬细胞的极化,使巨噬细胞倾向于M1表型,M1型巨噬细胞浸润于脂肪组织,分泌更多促炎因子,使正常胰岛素信号通路受阻,机体内葡萄糖耐量和胰岛素敏感性降低,产生胰岛素抵抗。因此,通过TLR2信号调节巨噬细胞极化可能是预防和治疗肥胖以及与之密切相关的2型糖尿病的新途径。