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T4多聚核苷酸磷酸酶(T4 polynucleotide phosphatase,T4 PNP)具有3′端磷酸酶活性,能够将核酸分子的3′端磷酸基团水解为羟基基团,在核酸分子末端损伤修复的过程中起着非常重要的作用。在正常的细胞生长过程中,如果T4 PNP酶活性表达异常往往会引发一系列疾病的发生,因此,建立一种简便、快速、高灵敏的T4 PNP酶活性检测的方法对生物研究、临床诊断具有重要意义。本文利用便携式血糖仪和基于氧化石墨烯的荧光传感平台,建立了两种检测T4 PNP酶活性的方法。具体内容如下:第一,利用便携式血糖仪检测T4 PNP酶的活性。实验中以链霉亲和素(Streptavidin,STV)修饰的磁性微球作为信号富集的载体,利用STV与生物素(biotin)的特异性结合作用,将5′端biotin修饰,3′端带有磷酸基团的模板DNA链固定到磁性微球表面,在T4 PNP酶的作用下模板DNA链的3′端磷酸基团发生去磷酸化作用,加入末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和dTTP后,在模板DNA链的3′端延伸一条富T碱基序列,然后将延伸产物作为引物捕获多条修饰有蔗糖转化酶的DNA探针,并与其互补杂交形成双链,将蔗糖转化酶间接的固定到磁性微球表面,再以蔗糖转化酶作为信号转换桥梁,加入蔗糖后,转化蔗糖为葡萄糖,通过血糖仪对体系中葡萄糖浓度的测定间接实现对T4 PNP酶活性的检测。结果表明,T4 PNP酶的浓度在10-6 U/mL~1 U/m L和1 U/m L~10 U/m L范围内,浓度与血糖仪的信号值呈线性相关,检出限约为5.5×10-7 U/m L。该方法检测仪器简单,灵敏度高,将该方法用于T4 PNP酶抑制剂的筛选,初步取得了较满意的结果。第二,基于氧化石墨烯生物传感检测T4 PNP酶的活性。实验中设计一条两端带有磷酸基团的模板DNA链,在T4 PNP酶的存在下,能特异性识别模板DNA 3′端磷酸基团并将磷酸基团水解为羟基,发生去磷酸化反应,然后在TdT和dTTP的共同作用下在模板DNA 3′端进行链延伸,延伸产物将捕获修饰有荧光染料分子的DNA探针P2形成双链结构,同时加入与模板DAN链互补的探针P1进行杂交,杂交反应完成后,在体系中加入一定浓度的氧化石墨烯,氧化石墨烯不会对双链DNA产生吸附作用,因此,体系中产生强烈的荧光信号。反之,当体系中不存在T4 PNP酶时,就不能发生去磷酸化反应,进而不能延伸,加入氧化石墨烯后,体系中成单链状态的DNA就会被氧化石墨烯吸附到其表面,并与探针P2修饰的荧光分子之间发生荧光共振能量转移,荧光猝灭。根据体系中荧光强度的变化来检测T4 PNP酶的活性。结果表明,T4 PNP酶的浓度在0.001 U/mL~0.5 U/mL和0.5 U/mL~20 U/m L范围内时,浓度的对数与荧光信号强度呈线性相关,检出限约为0.0008 U/mL。该方法初步用于T4 PNP酶抑制剂的筛选,取得了较满意的结果。