论文部分内容阅读
毛竹(Phyllostachys edulis)属于禾本科(Poaceae)竹亚科(Bambusoideas)刚竹属(Phyllostachys),是我国特有的传统经营竹种,作为具有良好生态效益和社会效益、集材用、食用、观赏、环保等众多用途于一体的优良竹种,毛竹在解决生态环境恶化、资源匮乏等方面发挥重要作用。毛竹营养生长周期长、开花时期不确定,并且开花后整株植株彻底死亡,导致竹林面积减少,对经济发展和生态环境造成重大损失和破坏。因此本文以毛竹不同发育时期的花为研究对象,旨在以毛竹花发育调控机理为研究视角,通过石蜡切片、转录组测序、表达谱测序、实时定量、Western blot和原位杂交等研究方法,力图找到毛竹花发育过程中关键的调控途径,并筛选出与花发育相关的关键基因,为竹类植物花发育的调控研究提供借鉴。主要研究结果如下:1.毛竹花序为复穗状花序,长约7-9 cm,每个花序含有数枚假小穗,每个假小穗又含有小花1-6朵不等。通过解剖观察,毛竹的小花包括外稃、内稃2枚、磷片3枚、雌蕊1枚和雄蕊3枚。根据解剖形态特征,将毛竹花序的发育过程分为花芽形成期、花序伸长期、颖花分化期和幼胚形成期四个阶段。2.应用Illumina高通量测序技术对毛竹未开花时的叶片和花进行转录组测序,分别得到5 G的原始数据,及68,305,136和67,617,866条clean reads。CK(未开花毛竹的叶片)样本和F(开花混合样)样本进行基因表达量的差异分析,以FDR≤0.001且log2Ratio≥1为标准,共筛选出11,703个差异表达显著基因;其中3,921和3,301个基因参与RNA转运通路和mRNA的监督途径,1,582个基因参与植物-病原体互作途径以及1,293个基因参与植物激素信号转导途径。3.在F1、F2、F3、F4表达谱中均得到1,000万条以上clean reads。以CK为参考基因,与F1、F2、F3和F4表达谱进行比较,发现CK/F1中,有9,735个基因上调,2,859个基因下调;CK/F2中,有10,055个基因上调,2,874个基因下调;CK/F3中,有9,237个基因上调,3,096个基因下调;CK/F4中,有6,172个基因上调,3,615个基因下调。利用qRT-PCR验证差异表达基因的表达模式,所得结果与表达谱测序结果趋势一致。4.差异基因进行KEGG Pathway功能注释,共得到128条代谢通路,通过聚类分析,128条代谢通路可以明显地划分为两个群体,即表达上调群体和表达下调群体。上调群体中表达量最高的路径为植物激素信号转导通路、内质网蛋白质加工通路和植物与病原菌互作通路;下调群体中表达量变化最大的路径为光合作用通路、天线蛋白通路、光合生物固氮通路。5.通过毛竹转录组和表达谱的测序数据,发现了众多与逆境相关的基因和转录因子家族,包括类钙调素蛋白(Calmodulin Like Protein,CMLs)基因、WRKY转录因子、NAC(NAM,ATAF and CUC)转录因子、紫外辐射敏感蛋白RAD23基因、Dof转录因子、热激蛋白(HSP20、70、90)基因、茉莉酸受体ZIM结构域包含蛋白(Jasmonate ZIM domain-containing protein,JAZ)、MYC2转录因子和FLS2、PR1、RPS2、RPS5等病程相关基因。6.系统进化分析表明,PheDof-1属于MCOG C亚家族成员;Phe MADS-14属于AP/AGL9家族成员。利用qRT-PCR和Western Blot技术检测花发育不同时期基因的表达情况,发现PheDof-1基因在毛竹花发育早期高量表达;PheMADS-14则在毛竹盛花期及幼胚形成期的表达最高,而花芽形成期的表达较少。原位表达的结果使我们初步确定了这两个基因的时空表达模式:PheDof-1的表达最初出现在顶端生长锥及花序轴部位,随着花器官原基的进一步分化,PheDof-1主要在内颖、外颖及苞片中阳性表达;PheMADS-14在毛竹花器官中表达,主要集中在细胞分裂旺盛的部位如雌蕊原基和雄蕊原基、花粉管的形成以及苞片等细胞。本论文首次以毛竹全基因组序列为参考基因,利用Illumina高通量测序技术对毛竹未开花时的叶片和花的转录组以及不同发育时期花的表达谱进行分析,高通量获得毛竹花发育相关的基因信息,并探究PheDof-1和PheMADS-14基因在毛竹花发育中的调控机制,这为揭示毛竹花发育的分子调控途径提供理论基础。