LPS对THP-1细胞CD14表达的影响

来源 :温州医学院 温州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hanpiaofeng
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目的:   从蛋白质和基因两个水平观察脂多糖(LPS)对THP-1(Humanacutemonocyticleukemiacellline)细胞可溶性CD14(SolubleCD14,sCD14)、膜CD14(MembraneCD14,mCD14)及CD14mRNA表达的影响及sCD14、mCD14与CD14mRNA表达之间的关系。   方法:   培养的THP-1单核细胞株,加入佛波脂(PHORBOL12-MYRISTATE13-ACETATE,PMA)诱导分化成THP-1巨噬细胞。在THP-1巨噬细胞中加入不同浓度的LPS,刺激不同的时间。用酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测细胞上清液中sCD14蛋白质的含量;用流式细胞术(Flowcytometry,FCM)检测细胞膜mCD14蛋白质的量;用实时荧光定量PCR检测细胞内CD14mRNA的表达情况。采用SPSS16.0统计软件对实验数据进行统计分析。根据多因素方差分析法比较不同质量浓度LPS不同时间刺激细胞sCD14、mCD14及CD14mRNA表达的变化,直线相关分析sCD14、mCD14及CD14mRNA表达之间的关系。   结果:   1、PMA诱导THP-1单核细胞转化后,细胞由悬浮生长变为贴壁生长。实验中PMA诱导6h时观察已经有部分细胞贴壁,18h大部分细胞已经完成贴壁,24h后所有细胞几乎完全贴壁。   2、不同质量浓度LPS不同时间刺激细胞sCD14表达量的变化   在时间-效应关系上:随着LPS刺激时间的延长,sCD14的表达增强,3、5h和0.5、1、8h相比,sCD14的表达均有显著性差异(P<0.01);LPS浓度为0ng/ml时,sCD14的表达随时间的延长而增强,相关系数r=0.915,P=0.029<0.05,8h达最高值(1044.39士12.21),与0.5h(265±13.93)和1h(201.45±9.46)比较有显著性差异(P<0.01);LPS浓度为0.1ng/ml时,8hsCD14的表达(445.64±8.64)降幅最大,与对照(1044.39士12.21)比较有显著性差异(P<0.01);LPS浓度为10ng/ml时,5hsCD14的表达达最高值(1216.66±3.35),与其余各组比较有显著性差异(P<0.05);LPS浓度为100ng/ml时,3hsCD14的表达达最高值(1320.25±107.37),与对照(768.43±19.98)及其余各组比较有显著性差异(P<0.01)。   在剂量-效应关系上:随着LPS浓度的增高,3、5、8hsCD14的表达变化较大;当LPS刺激细胞3h时,sCD14的表达随LPS浓度的升高而增强,相关系数r=0.963,P=0.002<0.01,且100ng/ml时达最高值(1320.25±107.37),与对照(768.43±19.98)比较有显著性差异(P<0.01);5h时,sCD14的表达随LPS浓度的增高先增强后减弱,10ng/ml时达最高值(1216.66±3.35);刺激8h,sCD14的表达随LPS浓度的增高而减弱,0.1ng/ml时sCD14的表达降幅最大(445.64±8.64),100ng/ml时达最低值(211.6±14.14),与对照(1044.39±12.21)比较有显著性差异(P<0.01)。3、不同质量浓度LPS不同时间刺激细胞mCD14表达量的变化   在时间-效应关系上:随着LPS刺激时间的延长,mCD14的表达增强,3、5hmCD14的表达最高;LPS浓度为0ng/ml时,mCD14的表达随时间的延长而增强,相关系数r=0.945,P=0.015<0.05,8h达最高值(4.23%士2.11%),且随着时间的延长,sCD14的表达与mCD14的表达呈正相关,相关系数r=0.969,P=0.006<0.01;LPS浓度为0.1ng/ml时,随着时间的延长mCD14的表达先增高后降低,8h(1.95%士0.74%)降幅最大,与对照(4.23%士2.11%)比较有显著性差异(P<0.01),但时间与mCD14的表达之间无相关性,而随着时间的延长,sCD14的表达与mCD14的表达呈正相关,相关系数r=0.944,P=0.016<0.05;刺激前3h内,随着时间的延长mCD14的表达增强,当LPS浓度为100ng/ml时达最高值(6.9%士2.19%);直至5h,LPS浓度为1ng/ml时mCD14的表达开始减弱。   在剂量-效应关系上:随着LPS浓度的增高,3、5、8hsCD14的表达变化较大;当LPS刺激细胞0.5h时,浓度与mCD14的表达之间无相关性,而随着LPS浓度的增高sCD14的表达与mCD14的表达呈负相关,相关系数r=-0.839,P=0.037<0.05;1h时,mCD14的表达随LPS浓度的升高而增强,相关系数r=0.839,P=0.037<0.05,100ng/ml时达最高值(3.24±1.95),与对照(1.25%士0.34%)比较有显著性差异(P<0.01);3h时,100ng/ml时达最高值(6.9%±2.19%),与对照(2.41%士1.09%)比较有显著性差异(P<0.01);5h时,mCD14的表达随LPS浓度的增高先增强后减弱,1ng/ml时达最高值(6.42%士2.18%);刺激8h,mCD14的表达都比对照弱,1、10ng/ml时达最低值(1.58%±0.48%)与对照(4.23%±2.11%)比较有显著性差异(P<0.01)。   4、不同质量浓度LPS不同时间刺激细胞CD14mRNA表达量的变化   在时间-效应关系上:随着LPS刺激时间的延长,CD14mRNA的表达增强,3hCD14mRNA的表达最高;起始3h,CD14mRNA的表达随LPS浓度增高而增强,LPS浓度为100ng/ml时达最高值为对照的256倍(P<0.01);5hCD14mRNA的表达明显减弱,LPS浓度为0.1ng/ml时达最低值仅为对照的1/64(P<0.01),接着随LPS浓度增高而增强,但是都低于对照(P<0.05);8h时CD14mRNA的表达呈双向表达,在LPS浓度为10ng/ml时达最高值为对照的64倍(P<0.01)。CD14mRNA的表达与LPS的刺激时间之间无相关性。   在剂量-效应关系上:随着LPS浓度的增高,CD14mRNA的表达变化较大;当LPS刺激细胞0.5h时,CD14mRNA的表达随着浓度的增高而增强,相关系数r=0.813,P=0.049<0.05,100ng/ml时达最高值为对照的256倍(P<0.01),而sCD14与CD14mRNA的表达之间呈负相关,相关系数r=-0.884,P=0.019<0.05;3h时,CD14mRNA的表达与浓度间呈正相关,相关系数r=0.822,P=0.041<0.05,且随着LPS浓度的增高CD14mRNA与mCD14的表达呈正相关,相关系数r=0.988,P<0.01,而sCD14与CD14mRNA的表达之间无相关性,r=0.736,P=0.095>0.05。   结论:   1、PMA可以诱导悬浮生长的THP-1细胞为具有巨噬细胞性质的贴壁细胞。   2、未经LPS刺激的THP-1细胞可以自发表达sCD14、mCD14及CD14mRNA。   3、LPS的浓度及刺激细胞的时间影响sCD14、mCD14及CD14mRNA表达。   4、3hsCD14的表达与LPS浓度间具有剂量-效应关系。   5、LPS浓度为0ng/ml时,mCD14的表达与时间正相关,mCD14与sCD14的表达呈正相关;LPS浓度为0.1ng/ml时,mCD14与sCD14的表达呈正相关。LPS刺激细胞0.5h时,mCD14的表达与LPS浓度无相关性,mCD14与sCD14的表达呈负相关;1h时,mCD14的表达与LPS浓度呈正相关。   6、LPS刺激细胞0.5h时,CD14mRNA的表达与浓度呈正相关,CD14mRNA与sCD14的表达呈负相关;3h时,CD14mRNA的表达与浓度呈正相关,CD14mRNA与mCD14的表达呈正相关。CD14mRNA的表达与时间无相关性。
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