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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是对全球养猪业造成巨大经济损失的一种病毒性疾病，由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)引起。PRRSV主要引起仔猪的呼吸道疾病以及母猪繁殖障碍，由于PRRSV具有持续感染、易变异以及非中和抗体介导的再感染等特性，使该病控制变得更加复杂。以前的研究证明，PRRSV病毒蛋白通过注射途径免疫接种不能产生有效的免疫保护，但经滴鼻黏膜免疫是否产生有效的免疫保护反应还不清楚。霍乱毒素(cholera toxin，CT)B亚基是目前已知的有效的黏膜免疫佐剂之一，但CTB对PRRSV病毒蛋白经滴鼻免疫小鼠产生抗体影响的研究还未见报道。因此本试验以CTB为黏膜免疫佐剂，以GP5和M蛋白为抗原滴鼻免疫小鼠，利用间接ELISA方法分别检测免疫小鼠的唾液和血清中IgA及IgG抗体水平，并通过本实验室建立的基于PAM细胞中和试验方法分别检测其中和活性，探讨GP5和M蛋白经滴鼻免疫后是否产生有效的免疫保护反应。
本研究将构建的重组质粒pET-26b-CTB转化至大肠杆菌BL21(DE3)，加入IPTG诱导后表达的CTB蛋白经非变性SDS-PAGE电泳鉴定其是以五聚体形式存在的可溶性蛋白，并将CTB蛋白经镍柱纯化后通过Western blot检测，结果表明所表达的CTB蛋白与预期蛋白大小相符。
将实验室保存的PRRSV VR2332毒株在Marc-145细胞上进行增殖，通过RT-PCR分别扩增GP5和M全长基因片段，利用SOE-PCR技术分别扩增出GP5基因片段(缺失跨膜区66-125aa和信号肽1-31aa)、M基因片段(缺失强疏水序列19-88aa)，分别与原核表达载体pET-32a连接，构建重组质粒pET-32a-GP5和pET-32a-M，并分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导后分别成功表达出与预期蛋白大小一致的重组蛋白。表达的GP5和M重组蛋白均以包涵体形式存在，用尿素法进行纯化，纯化的蛋白分别以猪PRRSV阳性血清及鼠源His单抗为一抗通过Western blot检测，结果表明表达的GP5和M重组蛋白均可以被PRRSV阳性血清及鼠源His单抗识别，表明表达的GP5和M重组蛋白均有较好的免疫反应原性。
将PRRSV GP5和M重组蛋白以及全病毒灭活抗原分别与CTB佐剂按10∶1的比例混合制备成CTB黏膜佐剂疫苗，滴鼻免疫小鼠，试验小鼠随机分成6组，每组10只，1-3组分别用GP5、M重组蛋白及PRRSV灭活抗原的CTB黏膜佐剂疫苗免疫，每只小鼠免疫30μg抗原，4-6组分别用GP5、M重组蛋白及PRRSV灭活抗原免疫接种，每只小鼠免疫剂量均为30μg。每7d免疫一次，共免疫四次，每次免疫剂量相同。于首次免疫后第0d、7d、14d、21d、28d、35d和42d收集血清和唾液样品，以PRRSV全病毒作为间接ELISA包被抗原，分别检测血清中特异性抗体IgG及唾液中特异性抗体IgA。血清中特异性抗体IgG的检测结果表明加有CTB佐剂的GP5蛋白免疫组、M蛋白免疫组和PRRSV灭活抗原免疫组与不加CTB住剂的GP5蛋白免疫组、M蛋白免疫组和PRRSV灭活抗原免疫组血清中特异性抗体IgG水平均无统计学差异（P＞0.05），以上结果表明CTB佐剂对于GP5、M重组蛋白及PRRSV灭活抗原黏膜免疫产生体液免疫应答的影响不大。唾液中特异性抗体IgA的检测结果表明加有CTB佐剂的GP5蛋白免疫组、M蛋白免疫组和PRRSV灭活抗原免疫组唾液中的特异性抗体IgA水平均显著高于不加CTB佐剂的GP5蛋白免疫组、M蛋白免疫组和PRRSV灭活抗原免疫组（P＜0.05），以上结果表明CTB佐剂可以增强GP5、M蛋白及PRRSV灭活抗原滴鼻免疫后唾液中IgA的产生。
通过本实验室建立的基于PAM细胞中和试验方法，将上述获得的含有特异性抗体的唾液及血清样品分别在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)进行PRRSV的中和试验，通过绝对荧光定量PCR方法检测PRRSV mRNA的拷贝数，以抗体的病毒阻断率≥70％的最大抗体稀释度为该抗体的中和滴度。结果表明，原核表达的重组蛋白GP5、和M经滴鼻免疫小鼠后获得的血清特异性抗体IgG中和PRRSV的滴度均＜1∶2，说明重组蛋白GP5和M滴鼻免疫后获得的抗血清均不具有中和PRRSV病毒的能力;原核表达的重组蛋白GP5和M滴鼻免疫小鼠后获得的唾液中的特异性抗体IgA中和滴度均＜1∶2，说明重组蛋白GP5和M滴鼻免疫后获得的唾液中特异性抗体均不具有中和PRRSV病毒的能力;以上结果表明CTB佐剂与PRRSV GP5和M蛋白分别混合滴鼻免疫小鼠后产生的特异性抗体未达到免疫保护作用的中和抗体水平。
本研究将构建的重组质粒pET-26b-CTB转化至大肠杆菌BL21(DE3)，加入IPTG诱导后表达的CTB蛋白经非变性SDS-PAGE电泳鉴定其是以五聚体形式存在的可溶性蛋白，并将CTB蛋白经镍柱纯化后通过Western blot检测，结果表明所表达的CTB蛋白与预期蛋白大小相符。
将实验室保存的PRRSV VR2332毒株在Marc-145细胞上进行增殖，通过RT-PCR分别扩增GP5和M全长基因片段，利用SOE-PCR技术分别扩增出GP5基因片段(缺失跨膜区66-125aa和信号肽1-31aa)、M基因片段(缺失强疏水序列19-88aa)，分别与原核表达载体pET-32a连接，构建重组质粒pET-32a-GP5和pET-32a-M，并分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导后分别成功表达出与预期蛋白大小一致的重组蛋白。表达的GP5和M重组蛋白均以包涵体形式存在，用尿素法进行纯化，纯化的蛋白分别以猪PRRSV阳性血清及鼠源His单抗为一抗通过Western blot检测，结果表明表达的GP5和M重组蛋白均可以被PRRSV阳性血清及鼠源His单抗识别，表明表达的GP5和M重组蛋白均有较好的免疫反应原性。
将PRRSV GP5和M重组蛋白以及全病毒灭活抗原分别与CTB佐剂按10∶1的比例混合制备成CTB黏膜佐剂疫苗，滴鼻免疫小鼠，试验小鼠随机分成6组，每组10只，1-3组分别用GP5、M重组蛋白及PRRSV灭活抗原的CTB黏膜佐剂疫苗免疫，每只小鼠免疫30μg抗原，4-6组分别用GP5、M重组蛋白及PRRSV灭活抗原免疫接种，每只小鼠免疫剂量均为30μg。每7d免疫一次，共免疫四次，每次免疫剂量相同。于首次免疫后第0d、7d、14d、21d、28d、35d和42d收集血清和唾液样品，以PRRSV全病毒作为间接ELISA包被抗原，分别检测血清中特异性抗体IgG及唾液中特异性抗体IgA。血清中特异性抗体IgG的检测结果表明加有CTB佐剂的GP5蛋白免疫组、M蛋白免疫组和PRRSV灭活抗原免疫组与不加CTB住剂的GP5蛋白免疫组、M蛋白免疫组和PRRSV灭活抗原免疫组血清中特异性抗体IgG水平均无统计学差异（P＞0.05），以上结果表明CTB佐剂对于GP5、M重组蛋白及PRRSV灭活抗原黏膜免疫产生体液免疫应答的影响不大。唾液中特异性抗体IgA的检测结果表明加有CTB佐剂的GP5蛋白免疫组、M蛋白免疫组和PRRSV灭活抗原免疫组唾液中的特异性抗体IgA水平均显著高于不加CTB佐剂的GP5蛋白免疫组、M蛋白免疫组和PRRSV灭活抗原免疫组（P＜0.05），以上结果表明CTB佐剂可以增强GP5、M蛋白及PRRSV灭活抗原滴鼻免疫后唾液中IgA的产生。
通过本实验室建立的基于PAM细胞中和试验方法，将上述获得的含有特异性抗体的唾液及血清样品分别在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)进行PRRSV的中和试验，通过绝对荧光定量PCR方法检测PRRSV mRNA的拷贝数，以抗体的病毒阻断率≥70％的最大抗体稀释度为该抗体的中和滴度。结果表明，原核表达的重组蛋白GP5、和M经滴鼻免疫小鼠后获得的血清特异性抗体IgG中和PRRSV的滴度均＜1∶2，说明重组蛋白GP5和M滴鼻免疫后获得的抗血清均不具有中和PRRSV病毒的能力;原核表达的重组蛋白GP5和M滴鼻免疫小鼠后获得的唾液中的特异性抗体IgA中和滴度均＜1∶2，说明重组蛋白GP5和M滴鼻免疫后获得的唾液中特异性抗体均不具有中和PRRSV病毒的能力;以上结果表明CTB佐剂与PRRSV GP5和M蛋白分别混合滴鼻免疫小鼠后产生的特异性抗体未达到免疫保护作用的中和抗体水平。