第一部分背景阿尔茨海默病是一种慢性的退行性病变。由于其发病隐匿,进展缓慢,临床症状以各种失能为主并且难以治疗,已经成为了威胁老年人健康的第二大疾病。因此,有效的治疗阿尔茨海默病是全人类所面对的一个重大议题。目前,人们对于阿尔茨海默病的病理机制的了解仍不完善,而治疗阿尔茨海默病的药物大部分仍旧停留在对症支持治疗的阶段。美国FDA批准的有效治疗阿尔茨海默病的5类药物中,有4类都为胆碱酯酶抑制剂,并且只能针对轻到中度的阿尔茨海默病,对重度的阿尔茨海默病基本无效,因此从探讨新的治疗阿尔茨海默病的手段和方法来减缓或者治愈脑部的这种退行性病变极为重要。乙酰胆碱,作为最早发现的神经递质,在阿尔茨海默病的病理机制中起着极为重要的作用。内源性的乙酰胆碱在记忆的获取、解码、巩固、再巩固、消除以及恢复中都起着十分重要的作用。在阿尔茨海默病的发病过程中,慢性的神经退行性病变的主要特征之一就是胆碱能神经元的丢失,但是在疾病发展的早期,胆碱能神经元并没有丢失,而是收缩丢掉其表型标记物或者处于一个萎缩的状态,因此,如果能在阿尔茨海默病的早期对胆碱能神经元进行治疗阻止其凋亡,那么也许可以挽救由于胆碱能神经元缺失所造成行为以及记忆的异常。DAPK1是一类Ca2+/钙调蛋白,已有研究表明,该蛋白在脑卒中的缺血再灌注损伤时,可以被激活并导致神经元的程序性死亡。同时DAPK1蛋白也参与了元退行性变异种的Tau蛋白的过度磷酸化,但是,在阿尔茨海默病中,DAPK1是否也介导了神经元的程序性死亡,而其是如何参与Tau的过度磷酸化的机制尚不清楚。目的观察DAPK1是否参与了阿尔茨海默病的退行性病变并探讨其相关的作用机制方法本实验采用了3月龄的诱导型转基因小鼠。使用Cre/loxp系统特异性的敲除转基因小鼠胆碱能神经元中的DAPK1激酶结构域。PCR得到转基因均为阳性的纯合子转基因小鼠。首先使用免疫荧光技术检测了Cre/loxp系统的工作是否正常。其次对进行了他莫昔芬诱导的小鼠以及使用玉米油的对照组进行了矿场、高架十字迷宫以及水迷宫的行为学检测。接着使用立体定位注射技术通过微量注射泵在使用他莫昔芬注射组的小鼠的双侧侧脑室部位注射Aβ以制造阿尔茨海默病小鼠的模型。并设置在侧脑室注射PBS的阴性对照组。对上述小鼠再次进行矿场实验、高架十字迷宫以及水迷宫的行为学检测。采用电生理技术,记录上述小鼠的单个细胞的电幅度以及频率,并记录其LTP诱导和表达的水平。使用蛋白免疫印迹技术对上述小鼠脑内的Tau及其相关蛋白的表达水平进行了检测。最后用高尔基染色对上述小鼠神经元树突上的树突棘进行了形态以及数目上的计算。结果经过10天的他莫昔芬诱导之后,纯合子转基因小鼠中的Cre重组酶特异性的表达在了胆碱能神经元内,并且能够共定位。对空白对照组、注射了他莫昔芬的野生型小鼠、注射了玉米油的转基因小鼠以及注射了他莫昔芬的转基因小鼠的各项行为学检测结果进行分析。其中,矿场实验表明小鼠的运动能力以及一般的行为状态、本身具有的好奇欲并没有发生改变。高架十字迷宫显示各组小鼠的焦虑状态一致,他莫昔芬的注射或者转基因的诱导并没有加深或者消除小鼠的一般焦虑。Morris水迷宫检测显示各组小鼠的学习与记忆功能均一致并没有得到损害或提高。随后我们对注射过他莫昔芬的纯合子转基因小鼠以及野生型小鼠进行阿尔茨海默病的造模,即在其双侧侧脑室注射AB,并使用PBS作为其空白对照组。通过DAB染色可以检测到Ap确实在小鼠的海马部位有所沉积。其后,我们对注射了他莫昔芬并双侧侧脑室注射PBS的野生型小鼠、注射了他莫昔芬的双侧侧脑室注射AB、注射他莫昔芬并双侧侧脑室注射PBS的转基因小鼠以及注射他莫昔芬并双侧侧脑室注射Ap的四组小鼠进行行为学的检测。注射了Ap的野生型小鼠组其在矿场实验中移动的距离及站立次数减少；在高架十字实验中其位于闭合壁的时间延长；在水迷宫实验中,其学习训练的潜伏期明显延长并且在第四天潜伏期还存在反复。而敲除了胆碱能神经元中DAPK1激酶结构域的小鼠可以逆转这些变化。说明小鼠的空间学习能力和记忆形成了障碍。对不同组的小鼠进行了LTP的检测。免疫印迹显示Ap的注射没有引起了各组小鼠脑内Tau的总量的改变,而是增加了磷酸化的Tau的表达量,而敲除了胆碱能神经元中DAPK1激酶结构域的小鼠并没有使Tau的磷酸化减少。最后通过高尔基染色对小鼠的树突棘进行观察以及计算显示,注射了Ap的野生型小鼠其树突棘的形态有所改变,数量也随之减少,敲除了胆碱能神经元中DAPK1激酶结构域的小鼠的树突棘的形状以及数量并没有发生太大变化。结论在转基因小鼠中成功的诱导胆碱能神经元敲除的DAPK1蛋白的激酶结构域,可以维持由于Ap导致的胆碱能神经元的功能损害,从而使乙酰胆碱的分泌保持正常,维持LTP的正常生理功能,使小鼠的空间学习与记忆功能不受到损害。第二部分背景脑卒中是一类以的脑部的血流障碍导致的大脑局部缺血的一类严重的神经性疾病。其以高发病率、高死亡率、高致残率,“三高”的特征严重威胁着人类的生命与健康。因此寻求有效治疗该疾病的药物极为重要。在脑卒中发病后的部分病人会产生认知功能的障碍,但目前并未有针对认知功能障碍的药物性治疗,多以对症、改善循环和康复训练为主。因此,研发出可以改善脑卒中后的认知功能障碍的药物很有意义。胆碱神经元在大脑形成学习和记忆的过程中都起着极为重要的作用。大多的神经退行性病变都与胆碱能神经元有关。目前的研究认为,脑卒中后的认知功能的障碍与大脑的退行性病变以及血管的损害。因此若是在疾病的早期就针对性的对大脑的退行性病变进行治疗和干预,那么就也许可以改善或者治愈脑卒中后所导致的认知功能的障碍。DAPK1是一类丝氨酸/苏氨酸Ca2+依赖型蛋白,其在脑卒中发生后可以被激活,使大量Ca2+流入细胞内,引起一系列的细胞凋亡。因此我们对胆碱能神经元在脑卒中后的作用进行了探讨,并且特异性的敲除了DAPK1的激酶结构域,探讨该敲除是否能保护部分的胆碱能神经元免于缺血再灌注的损伤。方法本实验采用了3月龄的诱导型转基因小鼠。使用Cre/Ioxp系统特异性的敲除转基因小鼠胆碱能神经元中的DAPK1激酶结构域。PCR得到转基因均为阳性的纯合子转基因小鼠。对各组小鼠进行了大脑中动脉栓塞模型,并使用TTC染色分别对术后1、3、7天的脑组织进行了染色,使用Image J对其面积进行分析。然后对于7天的小鼠进行灌流并作Fluoro-Jade C和ChAT的双重染色,观察在梗死周边区的胆碱能神经元的形态以及数量是否发生变化,并进行统计。结果敲除了胆碱能神经元中DAPK1激酶结构域的小鼠与对照组的小鼠相比,其MCAO术后1、3、7天的1缺血面积没有显著差异,FJ-C以及免疫荧光的双重染色可见,敲除了胆碱能神经元中DAPK1激酶结构域的小鼠其在缺血周围的胆碱能神经元的形态发生了变化,形态上更近似于基底前脑的胆碱能神经元,数目相较于空白对照组也有所增加。结论特异性的敲除了DAPK1的激酶结构域可以保护部分的胆碱能神经元免于缺血再灌注的损伤,但不能减少缺血再灌注损伤的面积