论文部分内容阅读
协同刺激分子根据其结构的不同,一般分为TNF/TNFR和B7/CD28两大超家族。近几年,B7/CD28家族成员不断扩大,其中PD-1是新近发现的协同刺激分子之一。PD-1分子属于CD28家族,是55KDa的I型跨膜糖蛋白,胞外区包含一个IgV样结构域,此结构域及胞外段的糖基化被认为在与配体的结合中发挥重要的作用。一系列的研究表明,PD-1通过与其两个配体PD-L1和PD-L2的作用而抑制T、B细胞的活化及细胞因子的产生,在维持机体的外周耐受发挥至关重要的作用。同时,PD-1分子与一系列疾病的免疫病理发生和发展密切相关。因此,PD-1分子成为近年来免疫学研究的热点,有望成为肿瘤、自身免疫性疾病和病毒感染性疾病的免疫干预治疗的有效靶分子。本课题研究以高表达人PD-1分子的基因转染细胞L929/PD-1作为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,以L929/PD-1作为抗体筛选细胞,L929/mock为对照细胞,经间接免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选和多次克隆化培养,筛选出分泌特异性鼠抗人PD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为6E2 mAb和10B5 mAb,Western-blotting分析显示,两株抗体都可以特异性识别L929/PD-1细胞上大约55KD大小的蛋白质,而不能识别L929/mock。抗原位点竞争抑制实验提示2株单抗与商品化的anti-PD-1-PE mAb识别细胞抗原结合位点不同,对6E2 mAb生物学功能的研究结果提示,该单抗能够识别活化T细胞表达的PD-1分子,且在体外能够显著抑制T细胞的增殖和细胞因子的分泌,是一株具有较好效应的功能性单克隆抗体。在此基础上,利用两株识别不同抗原表位的鼠抗人PD-1单克隆抗体6E2和10B5分别作为包被抗体和检测抗体,采用双抗体酶联免疫夹心法,成功研制出特异性检测人sPD-1的ELISA方法,并对其稳定性、精确性和特异性进行分析。结果显示,在抗原浓度为1.56-100ng/ml范围内有良好的线性关系,并具有良好的稳定性、准确性和特异性。鉴于至今尚无商品化sPD-1的检测试剂,该试剂盒成功地研制,具有重要的研究和运用价值。通过RT-PCR的方法获得人PD-1全长(PD-1)基因,设计特异性引物,PCR方法获得PD-1Δex3基因的2个cDNA片段,通过重组PCR的方法获得ΔPD-1基因,将目的片段双酶切后与pIRES2-EGFP真核表达载体连接,构建重组真核表达载体。经测序正确后,按照脂质体转染法将重组载体导入293T细胞。FCM分析和Western blot检测结果表明,PD-1转染细胞膜表面高表达PD-1蛋白,细胞培养上清中无可溶型PD-1(sPD-1)蛋白,而ΔPD-1转染细胞膜表面不表达PD-1蛋白,细胞培养上清中则有大量sPD-1。间接免疫荧光实验结果表明,PD-1Δex3基因编码的蛋白——sPD-1能够与PD-1两种配体产生特异性结合,由此显示,sPD-1具有相应的生物学功能。综上所述,本课题成功成功研制出能稳定分泌特异性功能型鼠抗人PD-1单克隆抗体,在此基础上研制出检测人sPD-1的ELISA试剂盒。同时还成功进行PD-1Δex3基因编码蛋白的真核表达,证实PD-1Δex3基因编码sPD-1蛋白,该蛋白具有良好的生物学活性,为进一步研究PD-1Δex3在PD-1/PD-L信号通路中的生物学作用提供了有价值的物质基础。