基质小泡(Matrix Vesicles,MVs)是一类直径为20-200nm的膜包被的囊泡状结构,主要来源于软骨细胞、成骨细胞及成牙质细胞。MVs起源于内质网,携带各种蛋白质及Ca2+等以出芽的方式分泌到细胞外基质,在释放过程中不断吸收Ca2+和PO43-形成无定形磷酸钙,最终沉淀在胶原纤维上无定形磷酸钙形成更坚硬的羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA),羟基磷灰石在MVs中继续生长,会刺破MVs的膜,定位于胶原上,从而启动细胞外基质的矿化。目前已经发现MVs中存在2,000多种蛋白以及多种脂类,这些组分是MVs发挥功能的关键成分,其中多种蛋白已经证明在矿化过程中起作用,但是存在于MVs中的蛋白质是否起作用,是否能够通过调控MVs的活性和功能来参与矿化,这些都不清楚。另外,MVs在异位骨化等病理性的矿化中也起着重要的作用,如MVs的功能增强是动脉粥样硬化发生的重要病理机制。尽管MVs在矿化过程中起重要作用,但是目前对MVs功能的调控机制知之甚少。细胞粘合素C(Tenascin C,TNC)是Tenascin家族成员,是一种具有独特的六臂体结构的寡聚糖蛋白,由六个相同的亚基在NH2端通过二硫键相连。在成人中,主要由间充质细胞分泌,少量的上皮细胞也会分泌。实验室的前期研究中发现TNC随着矿化的进行表达量逐渐增加,并发现TNC是MVs的一种成分。已有研究证明,TNC在矿化的后期起作用,在前期作用不明显。但是,TNC影响矿化是通过调控MVs的活性和功能还是只局限于细胞水平,目前还不清楚。目的:本研究旨在探究TNC是否通过调控MVs的活性调控成骨细胞矿化的过程,并对其机制进行研究。方法:(1)采用含有抗坏血酸和β-磷酸甘油的矿化诱导液诱导Saos-2细胞成骨分化以及矿化,建立Saos-2细胞矿化模型。(2)将Saos-2细胞分为正常对照组和矿化诱导组,在正常对照组细胞中加入完全培养液,在矿化诱导组细胞中加入含有50μg/m L抗坏血酸和10m Mβ-磷酸甘油的诱导培养液,在诱导3、6、9天后进行矿化结节定性和定量检测,以Western检测TNC的表达量变化。(3)将Saos-2细胞分为阴性对照组和RNAi组(2组),阴性对照组在培养液中加入50μg/m L抗坏血酸和10m Mβ-磷酸甘油的诱导培养液及阴性对照的si RNA片段。三组细胞在培养第3天分别进行矿化相关基因ALP,Runx2和COL1A1的表达量检测,在培养6天进行矿化结节定性、定量检测及Western验证相关蛋白表达量变化。(4)用Exo Quick TM试剂方法提取三组Saos-2细胞的细胞外分泌物。然后,用Western Blot的方法检测MVs中Annexins家族蛋白表达变化。(5)用p-NPP检测MVs的ALP活性,然后将提取后的MVs在含有蔗糖的TBS中重悬,种在铺有I型鼠尾胶原的24孔板中,加入矿化诱导液促使形成矿化结节,以检测MVs的体外矿化能力。结果:(1)茜素红染色结果显示矿化诱导组发生明显矿化,产生大量矿化结节,对照组只有少量矿化;茜素红定量结果显示诱导组产生的矿化结节是正常对照组的6倍左右,说明我们成功构建了Saos-2的体外矿化模型。(2)从Western Blot的结果我们可以看出随着矿化的进行TNC的表达量逐渐增加,在前期变化不明显,在诱导9天时增加明显。(3)RNAi后,从RT-q PCR的结果和Western Blot的结果可以看出加入干扰片段后TNC的表达量减少,达到了下调其表达的目的。(4)RNAi后,细胞培养3天后用RT-q PCR检测ALP、COL1A1表达量,这两个成骨标志基因表达量下降;ALP活性和染色显示阴性对照组的ALP活性和表达量比加入干扰片段的两组高。(5)Western Blot结果可以看出,在干扰后MVs上Anx家族蛋白的表达有一定程度的减少,但不是很明显。下调TNC的表达后MVs的矿化能力明显降低,说明TNC调控成骨细胞的矿化可能是通过调控MVs进行的;阴性对照组与干扰组MVs的ALP活性变化明显,说明该矿化的调控可能是通过调控MVs的ALP活性进行的。结论:TNC可以调控成骨细胞的矿化过程,这一过程可能是通过调控MVs的矿化能力及活性这一过程实现的。