论文部分内容阅读
猪瘟（classical swine fever,CSF）是一种以高热和免疫抑制为主要特征的高度接触性传染病,其病原体为猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）。在自然感染状态下,各年龄阶段的家猪和野猪均可感染发病。CSF在世界范围内广泛流行,每年给全球养猪业造成巨大的损失,是世界动物卫生组织要求通报的重要动物传染病之一。CSFV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒,含有一个长的开放阅读框,其基因组可作为mRNA直接翻译为病毒多聚蛋白而具有感染性。CSFV病毒粒子由结构蛋白Erns、E1、E2和核心蛋白组成,Erns作为瘟病毒属成员所特有的一种高度糖基化蛋白,具有RNase活性,能水解单链和双链的病毒RNA,抑制I型干扰素产生,从而抑制宿主的天然抗病毒免疫应答效应。同时,Erns蛋白具有胞外分泌特性,能与宿主细胞膜表面受体结合,介导病毒吸附和进入易感细胞。此外,Erns蛋白具有一定的细胞毒性,能诱导不同哺乳动物种属来源的T淋巴细胞凋亡,且未对细胞膜造成损伤,在CSFV感染和免疫抑制过程中发挥重要作用。在真核细胞中,分泌蛋白的氨基端通常含有一段具有高度疏水性的信号肽序列,能引导胞浆合成的前体蛋白转位至内质网膜上,信号肽经信号肽酶切除后,前体蛋白在内质网管腔内进行天冬酰胺连接的糖基化和二硫键形成等一系列转录后加工修饰,成为成熟蛋白,N-糖苷的形成有助于蛋白的分泌和功能发挥。Erns蛋白作为CSFV感染和致病过程中的重要致病因素,其胞外分泌可能是功能发挥的先决条件,因此,揭示调节Erns蛋白胞内加工的因子十分有必要。为表达猪瘟病毒Erns蛋白并制备其多克隆抗体,本研究首先获得了猪瘟病毒石门毒株Erns基因全长,并将其克隆至pET-28a原核表达载体上,重组质粒转化至原核表达菌株BL21（DE3）,IPTG诱导表达重组表达菌体,经超声破碎处理和SDS-PAGE检测,发现分子量约为25 kDa、主要以包涵体蛋白形式存在的重组蛋白Erns。在变性条件下,溶解的包涵体蛋白依次经镍柱亲和层析和切胶回收方法纯化获得了高纯度的重组蛋白Erns。经Western blot检测发现其具有良好的反应原性,能与抗6×组氨酸标签蛋白抗体和抗猪瘟病毒的高免血清发生特异性反应;此外,将纯化蛋白作为抗原多次免疫Balb/C小鼠,制备抗Erns重组蛋白的多克隆抗体,经间接ELISA检测发现免疫小鼠血清中Erns蛋白抗体效价高达1:50000。此外,通过间接荧光免疫和Weastern Blot验证获得的Erns蛋白多克隆抗体具有良好的特异反应性,能与病毒感染细胞中Erns蛋白天然结构及Erns-EGFP融合表达细胞的Erns蛋白发生特异性反应。Erns作为一种胞外分泌蛋白在猪瘟病毒感染过程中发挥多种功能,但到目前为止Erns蛋白加工和分泌的机制及功能并不太清楚。本研究通过在线软件SignalP分析预测,发现猪瘟病毒Erns蛋白上游,即Core蛋白羧基端,具有一段含20个氨基酸的信号肽序列（EKALLAWAVIAIMLYQPVEA）,为了探究该信号肽序列在Erns蛋白加工和分泌过程中的作用。将成功克隆基目的基因的p IRES-puro3重组质粒转染至ST细胞,经嘌呤霉素筛选获得了能稳定表达HCLV株源的Erns-EGFP融合蛋白（含有信号肽）和ΔErns-EGFP融合蛋白（去除信号肽）的ST细胞系。荧光显微镜观察,发现表达Erns-EGFP融合蛋白细胞系胞内荧光强度明显高于表达ΔErns-EGFP融合蛋白的,且均主要分布于细胞核周围。去除N-糖基化处理和Western Blot检测胞内带EGFP标签的融合蛋白差异表达情况,发现信号肽能显著促进胞内Erns蛋白的胞内表达,并能调节该蛋白的N-糖基化修饰。激光共聚焦显微镜分析发现缺失羧基端膜锚定序列和信号肽的Erns蛋白主要分布于细胞核内,但仅去除膜锚定区的Erns-EGFP融合蛋白能共定位于内质网,能进行N-糖基化修饰。为了进一步研究信号肽对Erns蛋白释放的影响,通过检测各细胞系培养上清中融合蛋白绿色荧光信号强度,发现信号肽能仅能促进Erns蛋白分泌至细胞上清中。此外,各细胞系培养上清经外泌小体试剂盒纯化以及Western Blot检测,发现只有糖基化修饰的Erns蛋白能以非可溶蛋白形式分泌至胞外,且经透射电镜观察,发现均纯化获得大量直径约30 nm的外泌小体。同时,去糖基化和Western Blot检测发现,胞外释放的Erns蛋白主要以较胞内更高的糖基化蛋白形式存在。多重序列比对发现HCLV株、石门株和GD53/2011流行株的信号肽序列氨基酸存在差异,瞬时表达分别三种毒株来源的Erns蛋白和ΔErns蛋白,并进行Western Blot检测,却发现不同毒力CSFV的信号肽均能调节Erns蛋白的胞内加工,但GD53/2011株Erns蛋白的糖基化程度较高。为了鉴定调节HCLV株Erns蛋白加工和释放的信号肽关键氨基酸位点,通过对猪瘟病毒不同基因亚型毒株的信号肽进行氨基酸序列进行比对,发现位于核心疏水区的序列251LLAWA255高度保守。瞬时表达截断氨基端、定点突变信号肽序列的Erns突变体,经Western Blot和培养上清荧光信号强度检测发现缺失251LLAW254氨基酸残基或251LL252或253AW254突变为NN（天冬酰胺）后,Erns蛋白突变体的N-糖苷完全被废除,且胞外分泌量显著下降。这些信号肽突变体经截断羧基端膜锚定序列后,荧光显微镜观察发现融合蛋白失去内质网锚定作用,主要分布于细胞核。此外,将251LL252和W254同时突变为丙氨酸（A）后,Erns蛋白突变体的糖基化蛋白表达量和分泌量均显著下降。结果表明氨基端信号肽中高度保守氨基酸残基251LLAW254决定了Erns蛋白的糖基化、内质网定位和释放。本研究利用原核表达系统,经亲和层析、切胶纯化获得了高纯度的重组蛋白Erns,并制备了高抗体效价的小鼠抗Erns蛋白多克隆抗体,有助于开展CSFV抗体水平检测和Erns蛋白功能相关研究。此外,基于构建的稳定表达Erns蛋白的ST细胞系,研究发现信号肽在猪瘟病毒Erns蛋白胞内表达、N-糖基化修饰和释放过程中发挥积极的调控作用。Erns蛋白主要以非可溶性的过度糖基化蛋白形式分泌至胞外。此外,高度保守氨基酸序列251LLAW254被鉴定为调节Erns蛋白加工和分泌的关键氨基酸基序,为进一步研究糖蛋白Erns胞内转运机制和分泌形式的鉴定奠定了基础。