以多西紫杉醇为佐剂的治疗性HUVEC疫苗研制及其抗肿瘤活性研究

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目的:乳腺癌是女性最常见的恶性疾病之一,且发病率呈逐年递增趋势,已对女性健康造成严重影响。肿瘤在发生发展过程中会产生大量的新生血管,通过阻断血管新生,能够达到遏制肿瘤持续生长和转移的目的。目前临床常用的抗肿瘤血管生成药物多为小分子抑制剂和单克隆抗体,由于其副作用较大、半衰期较短且容易产生耐药性,限制了在临床上的进一步应用。抗肿瘤血管生成疫苗是抗血管生成治疗的一个新领域,疫苗治疗具有抗瘤谱广、毒副作用低、药物易于到达靶部位、不易产生耐药性等优点。我们前期研究发现以人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)制备的疫苗具有抗肿瘤作用,但与其它肿瘤疫苗相比,在治疗性免疫中HUVEC疫苗抗肿瘤效果仍不理想,需要进一步增强其抗肿瘤作用。多西紫杉醇(Docetaxel,DOC)是乳腺癌临床治疗的一线化疗药物,已广泛应用,安全性较高。研究发现低剂量DOC可以作为有效的疫苗佐剂,增强疫苗的抗肿瘤免疫反应。本课题将DOC引入HUVEC疫苗治疗方案,考察DOC能否增强HUVEC疫苗诱导的免疫应答从而增强HUVEC疫苗在治疗性免疫中的抗肿瘤作用,并对其抗肿瘤机制进行探讨。方法:将BALB/c小鼠随机分为6组,分别为PBS对照组,HUVEC组,DOC(10 mg/kg)组,HUVEC-DOC1(HUVEC 疫苗+2.5mg/kgDOC)组,HUVEC-DOC2(HUVEC 疫苗+5 mg/kg DOC)组和 HUVEC-DOC3(HUVEC 疫苗+10 mg/kg DOC)组。通过皮下注射EMT-6和4T1小鼠乳腺癌肿瘤细胞,建立皮下移植瘤模型,考察不同治疗方案抗肿瘤生长的作用。通过尾静脉注射EMT-6和4T1小鼠乳腺癌肿瘤细胞,建立人工肺转移模型,考察不同治疗方案抗肿瘤转移情况。采用脾淋巴细胞增殖实验、细胞毒性T淋巴细胞杀伤实验检测给药后各不同治疗方案小鼠的细胞免疫应答水平。采用ELISA试剂盒检测小鼠免疫血清中INF-γ含量。取小鼠脾脏,采用流式细胞术,检测脾淋巴细胞中CD8+T淋巴细胞以及Treg细胞的含量。采用免疫荧光技术,检测各组小鼠肿瘤组织中CD8+T淋巴细胞浸润情况。采用CD31免疫组织化学技术,评估各组小鼠肿瘤中微血管的生成情况。HE染色法检测各组小鼠脏器的病理学变化,初步考察疫苗的毒副作用。结果:肿瘤生长曲线和剖取的小鼠肿瘤瘤重结果显示,相较于PBS组,其它各组都能不同程度的抑制肿瘤生长,HUVEC-DOC2组抑制作用最显著;与PBS组相比,其它各治疗组小鼠生存期都有不同程度的延长,其中HUVEC-DOC2组小鼠的生存时间最长;肺转移模型结果显示,与皮下移植瘤抑制肿瘤生长情况一致,HUVEC-DOC2组转移灶数目比其他组明显减少;T淋巴细胞增殖实验结果证实,除PBS组和DOC单药组外,其它四组T淋巴细胞增殖能力都有不同程度的增强,其中HUVEC-DOC2组增殖能力最强,接近于阳性对照组;CTL杀伤实验结果显示,当靶细胞为 HUVEC 细胞时,HUVEC 组、HUVEC-DOC1 组、HUVEC-DOC2组和HUVEC-DOC3组T淋巴细胞杀伤活力随效靶比的升高而增大,其杀伤能力也逐步增强,其中HUVEC-DOC2组杀伤能力最为强烈;ELISA实验检测,HUVEC-DOC2治疗组小鼠血清中INF-γ的含量相较于其它组明显升高(P<0.05);免疫荧光技术检测小鼠肿瘤组织中CD8+T淋巴细胞浸润程度结果发现,HUVEC-DOC2治疗组CD8+T淋巴细胞浸润程度比其它治疗组显著升高。流式细胞术实验结果同样证实,HUVEC-DOC2治疗组CD8+T淋巴细胞含量明显升高,Treg细胞表达明显降低;CD31免疫组织化学染色结果可以看出,HUVEC-DOC2组CD31的阳性表达量最低,该组肿瘤微血管数目最少;安全性考察的结果显示,各组小鼠的体重、日常行为活动、饮食等并无明显的差异,脏器切片HE染色结果显示,各组治疗方案在给药后小鼠的脏器并无明显的病理学改变。结论:HUVEC疫苗与低剂量DOC联用具有协同抗肿瘤作用,明显抑制肿瘤的生长及转移,抑制了肿瘤新生血管的生成,提高了T淋巴细胞的杀伤能力,诱导产生了明显的HUVEC特异性CD8+T淋巴细胞免疫应答,这可能是产生协同抗肿瘤增效作用的原因。
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