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咖啡酸(caffeicacid,CA)在药用植物(菊科、蔷薇科、无患子科等)中含量丰富,是一类天然的酚类化合物,具有抗炎、抗氧化作用。奶牛乳腺上皮细胞(bovine marmmary epithelial cells,bMEC)是乳汁合成、分泌的重要功能单位,是乳腺生长发育及泌乳功能调控机制研究的主要细胞模型,在奶牛乳房炎过程中易受损害。前期研究表明CA可以抑制脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)引起的bMEC结构损伤。巨噬细胞参与机体内非特异性与特异性免疫,乳房炎发生时,在递呈抗原与趋化中性粒细胞时,启动炎症反应。本研究在前期建立的LPS诱导bMEC结构损伤模型的基础上,给予Nox(non-phagocyticcelloxidase)抑制剂(DPI)、ROS清除剂(NAC)处理来探讨Nox-ROS信号在LPS诱导bMEC损伤和小鼠巨噬细胞系(RAW 264.7)炎症、氧化应激反应中的作用,及CA对该信号的调节机制。本研究将bMEC、RAW 264.7分别分为空白对照组(Con)、模型组(Mod)、ROS 清除剂组(NAC+LPS)、Nox 抑制剂(DPI+LPS)组、CA 治疗组(CA+LPS)、CA对照组(CA),采用流式细胞术检测细胞ROS含量、线粒体膜电位变化、细胞凋亡率;免疫印迹检测细胞NF-κB、Nrf2信号通路中关键蛋白的表达;激光共聚焦技术检测胞内核转录因子的定位情况,RT-PCR检测炎性因子表达,ELISA检测MDA表达量和SOD活性。研究结果如下:原代奶牛乳腺上皮细胞制备条件的优化。本试验采用胶原酶一步消化法简便快捷的培养了细胞活力良好的bMEC。CA 抑制 LPS 激活的 bMEC Nox-ROS 信号。LPS(50 μg/mL)刺激 bMEC 0.5 h:较Con组相比,Mod组ROS含量无显著差异(P>0.05),CA+LPS组和CA组ROS含量显著下降(P<0.01);LPS在0.5 h未引起细胞线粒体膜电位显著下降,在2 h、4 h、8 h线粒体膜电位显著下降(P<0.01)。LPS(50 μg/mL)刺激bMEC0.5h:与Con组相比,Mod组p-IKBα、p-p65表达量显著升高(P<0.01),p65核移位增多;与Mod组相比NAC+LPS、DPI+LPS、CA+LPS组和CA组p-p65、p-IκBα蛋白表达显著降低(P<0.01)、p65核移位减少。LPS(50μg/mL)刺激bMEC 12 h:与Con组相比,Mod组ROS含量显著升高(P<0.01)、线粒体膜电位显著降低(P<0.01)、细胞凋亡率显著升高(P<0.01)、Bax/Bcl-2表达显著升高(P<0.01);与Mod组相比,NAC+LPS组、DPI+LPS组、CA+LPS组和CA组ROS含量显著降低(P<0.01)、线粒体膜电位显著升高(P<0.01)、细胞凋亡率显著下降(P<0.01)、Bax/Bcl-2表达显著升高(P<0.01),Nrf2核蛋白表达显著降低(P<0.01),Nrf2核移位增多。与Con组相比,Mod组IL-6、TNF-α表达量显著升高(P<0.01)、IL-10表达量显著降低(P<0.01),与Mod组相比,NAC+LPS 组、DPI+LPS 组、CA+LPS 组 IL-6、TNF-α 表达量显著降低(P<0.01)、IL-10表达量显著升高(P<0.01)。与Con组相比,Mod组MDA含量显著升高(P<0.01)、SOD活性显著降低(P<0.01),与Mod组相比,NAC+LPS组、DPI+LPS组、CA+LPS组MDA含量显著降低(P<0.01)、SOD活性显著升高(P<0.01)CA 抑制 LPS 激活的 RAW 264.7 Nox-ROS 信号。LPS(1 μg/mL)刺激 RAW 264.7 0.5 h:与Con组相比,Mod组ROS含量显著升高(P<0.01)、线粒体膜电位显著下降(P<0.01)、p-p65、p-IκBα蛋白表达显著升高(P<0.01)、p65核移位增多;较Mod组相比,NAC+LPS组、DPI+LPS组、CA+LPS组和CA组ROS含量显著降低(P<0.01)、p-p65、p-IκBα蛋白表达显著下降(P<0.01)、p65核移位减少。LPS(1μg/mL)刺激RAW 264.7 12 h:与Con组相比,Mod组线粒体膜电位显著降低(P<0.01)、细胞凋亡率显著升高(P<0.01),Bax/Bcl-2表达显著升高(P<0.01)、Nrf2核蛋白表达显著升高(P<0.01),Nrf2核移位增多;与Mod组相比,NAC+LPS组、DPI+LPS组、CA+LPS组和CA组ROS含量显著降低(P<0.01)、线粒体膜电位显著升高(P<0.01)、细胞凋亡率显著下降(P<0.01)、Bax/Bcl-2表达显著降低(P<0.01),Nrf2核移位减少。与Con组相比,Mod组IL-6、TNF-α表达量显著升高(P<0.01)、IL-10表达量显著降低(P<0.01),与 Mod 组相比,NAC+LPS 组、DPI+LPS 组、CA+LPS 组 IL-6、TNF-α 表达量显著降低(P<0.01)、IL-10表达量显著升高(P<0.01)。与Con组相比,Mod组MDA含量显著升高(P<0.01)、SOD活性显著降低(P<0.01),较Mod组,NAC+LPS 组、DPI+LPS 组、CA+LPS 组 MDA 含量显著降低(P<0.01)、SOD活性显著升高(P<0.01)。研究表明,CA可抑制bMEC、RAW264.7Nox-ROS信号,调节细胞NF-κB、Nrf2信号通路,从而降低LPS引起的炎症、氧化应激损伤发挥抗炎抗氧化作用。