目的:通过对JNK/C-Jun信号通路的关键基因TNF-a，Rho，C-Abl，P-C-Jun，C-Jun，Cytc，Bax和ATF3调控二乙酰吗啡致神经元细胞凋亡的作用机制进行探讨，同时选择性地阻断、抑制或沉默JNK/C-Jun因子的凋亡信号传递通路关键靶点，对JNK/C-Jun信号转导通路在神经元细胞促凋亡的发生机制方面进行深入地探讨，为临床提出以JNK/C-Jun为靶标治疗二乙酰吗啡产生的脑病提供更可靠、更充分的科学依据。　　方法:　　(1)通过在体外进行原代小脑颗粒神经元细胞的培养，同时建立二乙酰吗啡致神经元凋亡的模型，采用激光共聚焦显微镜观察培养的细胞，并对小脑颗粒神经元细胞进行纯度鉴定;在不同浓度二乙酰吗啡作用同一时间和同一浓度二乙酰吗啡作用不同时间小脑颗粒神经元细胞处理时，对P-C-Jun、C-Jun及其激活途径相关蛋白TNF-a，Rho，C-Abl采取不同的实验方法进行检测，如:免疫荧光检测荧光表达强度、流式细胞术检测细胞凋亡率、实时荧光定量PCR检测mRNA的表达量、Western blot检测蛋白表达量。　　(2)在体外培养的原代小脑颗粒神经元细胞成功转染慢病毒72h后，建立二乙酰吗啡致神经元细胞凋亡模型，通过流式细胞技术、qRT-PCR、Western blot法对特异性抑制剂SP600125组、MLKs抑制剂CEP1347组及慢病毒组沉默C-Jun的小脑颗粒神经元细胞，检测细胞凋亡率，对各组细胞进行C-Jun及其相关促凋亡候选靶基因Cytc、Bax、ATF3 mRNA水平及蛋白水平表达的检测，分析其在二乙酰吗啡致神经元凋亡中的作用及意义。　　(3)通过剂量递增法注射二乙酰吗啡，建立大鼠二乙酰吗啡成瘾模型，对成瘾大鼠小脑颗粒神经元细胞凋亡的形态学变化采用常规HE染色和电子扫描电镜进行观察，进一步验证在动物实验模型上二乙酰吗啡致神经元凋亡的存在和JNK信号通路及其相关靶基因对神经元细胞凋亡的作用和影响，采用免疫组化、原位杂交及Western blot等方法检测相关蛋白TNF-a、Rho、C-Abl、P-C-Jun、C-Jun、Cytc、Bax和ATF3蛋白，进行二乙酰吗啡致神经元凋亡的机制研究。　　结果:　　(1)随着二乙酰吗啡作用小脑颗粒神经元细胞的浓度增加和时间延长，小脑颗粒神经元细胞凋亡数量逐渐增加，差异具有统计学意义。免疫荧光检测发现:100 ug/ml的二乙酰吗啡作用小脑颗粒细胞24h时，TNF-a、Rho和C-Jun蛋白呈高表达状态，与对照组相比较，差异有统计学意义;其中C-Abl蛋白表达没有明显变化，与对照组相比较，差异无统计学意义。随着二乙酰吗啡作用小脑颗粒细胞浓度的升高和作用时间的延长，TNF-a、Rho、C-JunmRNA和蛋白也逐渐升高，与对照组比较结果有差异，有统计学意义;而C-Abl蛋白的mRNA水平和蛋白水平表达均无明显的变化，与对照组比较，差异无统计学意义。　　(2)检测细胞凋亡率显示:在二乙酰吗啡与SP600125抑制剂组、二乙酰吗啡与CEP1347抑制剂组和二乙酰吗啡与慢病毒组中，细胞凋亡率均降低，与二乙酰吗啡组结果比较，差异有统计学意义(P=0.009，P=0.0162，P=0.0076)，与对照组结果比较差异无统计学意义。通过两组独立样本t检验发现，与对照组比较，在二乙酰吗啡与SP600125抑制剂组、二乙酰吗啡与CEP1347抑制剂组、二乙酰吗啡与慢病毒组中，Cytc，Bax，ATF3因子的mRNA表达量呈明显降低，差异有统计学意义，其中各组的C-Jun因子mRNA表达量明显降低，与对照组比较有差异，结果有统计学意义;同时，与对照组比较，P-C-Jun和C-Jun蛋白表达明显降低，结果有统计学意义，Cytc，Bax，ATF3蛋白表达亦呈现降低趋势，差异亦有统计学意义。　　(3)成功建立二乙酰吗啡大鼠成瘾模型，形态学观察发现:成瘾组小脑白质神经细胞数目减少，结构紊乱，神经细胞内出现小空泡，多个小空泡可以合并较大腔隙，周围炎症细胞浸润不明显;电子扫描电镜观察到小脑颗粒神经元细胞的突起明显减少、高度水肿，分布在毛细血管周围或神经毡内，与周围水肿的突触形成疏松的网孔状、神经毡呈现海绵状外观。小脑颗粒神经元细胞出现皱缩，细胞胞浆碎裂、线粒体嵴肿胀消失、出现断裂，空泡化，细胞核体积明显缩小并变形、核基质减少、消失、水肿。Tunnel检测发现:在二乙酰吗啡成瘾10d组、成瘾20d组、成瘾30d组和成瘾40d组中，小脑组织颗粒神经元细胞凋亡数量随着成瘾天数增加而逐渐增多，与对照组比较有差异，差异有统计学意义。免疫组化和Western Blot检测JNK/C-Jun信号通路及相关靶基因结果显示:在二乙酰吗啡成瘾10d组、成瘾20d组、成瘾30d组和成瘾40d组中，TNF-a，Rho，P-C-Jun，C-Jun，Cytc，Bax和ATF3蛋白也随成瘾天数增加而逐渐增多，与正常对照组比较，结果有统计学意义，而C-Abl蛋白在4组中均无明显变化，与对照组比较无明显差异，结果无统计学意义。　　结论:　　(1)在离体培养的二乙酰吗啡致神经元细胞凋亡模型中，P-C-Jun，C-Jun，TNF-a和Rho因子参与并调控二乙酰吗啡致神经元细胞凋亡的过程;同时随着二乙酰吗啡的浓度增加和作用时间延长细胞凋亡数量增多与P-C-Jun，C-Jun，TNF-a和Rho因子表达呈正向依赖关系;TNF-a和Rho因子与P-C-Jun和C-Jun因子在二乙酰吗啡致神经元细胞凋亡过程中变化趋势相同，说明对JNK/C-Jun信号通路激活的神经酰胺途径的相关蛋白TNF-a和Rac激活途径的相关蛋白Rho都在二乙酰吗啡致神经元凋亡的过程中发挥了作用，因此，TNF-a和Rho可作为二乙酰吗啡致神经元凋亡过程促凋亡因子;而旁路激活途径相关因子c-Abl在此凋亡过程无明显变化，证明c-Abl对JNK/C-Jun因子的激活无明显作用。　　(2)在二乙酰吗啡致神经元凋亡的细胞模型上分别采用三种方式进行阻断JNK/C-Jun信号通路的处理，如:JNK抑制剂SP600125、MLK抑制剂CEP1347和慢病毒沉默C-Jun因子，三种方式的干预均可明显降低二乙酰吗啡诱导小脑颗粒神经元细胞凋亡的数量，说明了该信号通路确实在小脑颗粒神经元细胞凋亡过程中发挥了重要作用，同时起到神经元的保护作用。其中慢病毒干预抑制神经元细胞的凋亡效率最高，对神经元的保护作用更为重要。在二乙酰吗啡致神经元凋亡的模型组中， C-Jun基因及其相关促凋亡基因Cytc、Bax和ATF3mRNA及蛋白表达结果均上调，说明Cytc、Bax和ATF基因发挥促凋亡作用;通过对C-Jun因子转录活性的抑制，Cytc、Bax和ATF3 mRNA和蛋白的表达在SP600125和CEP1347组明显下降，P-C-Jun和C-Jun在感染pLenti6.3/V5-DEST慢病毒组几乎完全被抑制，说明了C-Jun确实介导了促凋亡相关基因Cytc、Bax和ATF3的表达上调，因此这些基因可作为C-Jun的候选靶基因，对C-Jun因子的激活致神经元凋亡研究意义重大。　　(3)建立在体大鼠二乙酰吗啡成瘾模型，并通过HE染色、电子扫描电镜的检测观察，确定成瘾大鼠的海绵状白质脑病的病理改变及小脑颗粒神经元细胞凋亡的发生，神经元细胞凋亡数量增加与二乙酰吗啡作用的时间呈正向增高变化趋势，证实了海洛因海绵状白质脑病的存在;JNK/C-Jun及其相关靶基因蛋白的变化随着二乙酰吗啡干预大鼠时间的延长，TNF-α、Rho、P-C-Jun和C-Jun蛋白表达量逐渐呈现上升趋势，出现明显的时间和浓度依赖，而c-Abl蛋白表达无明显差异，这充分说明了TNF-α和Rho因子参与了二乙酰吗啡致神经元凋亡过程，并影响JNK/C-Jun信号通路的激活，而c-Abl因子与二乙酰吗啡致神经元凋亡作用不明显，无法证明c-Abl对JNK/C-Jun信号通路的激活有作用;Cytc、Bax和ATF3蛋白随着二乙酰吗啡作用再体神经元细胞时间的延长而呈现明显上升趋势，这也验证了Cytc、Bax和ATF3参与了二乙酰吗啡致神经元凋亡的过程;同时，Cytc、Bax和ATF3蛋白变化趋势与P-C-Jun和C-Jun蛋白变化趋势相似，证实了JNK/C-Jun信号通路介导了Cytc、Bax和ATF3因子的表达。