【摘 要】
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碱性亮氨酸拉链(bZIP)蛋白是真核生物转录因子和阻抑蛋白中最大且最保守的类型之一。在植物中,bZIP蛋白与ABA激素应答,光形态发生及器官建成的控制相关。本研究的目的在于深入
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碱性亮氨酸拉链(bZIP)蛋白是真核生物转录因子和阻抑蛋白中最大且最保守的类型之一。在植物中,bZIP蛋白与ABA激素应答,光形态发生及器官建成的控制相关。本研究的目的在于深入探讨植物bZIP转录因子与DNA元件G-box相互作用的规律:我们从水稻中分离了TRAB1,OSBZ8,OsNIF1,RF2a四个bZIP基因的碱性亮氨酸区段。将它们的这段基因片段导入酵母表达载体,进行酵母单杂交实验;同时提取酵母蛋白,在体外利用凝胶阻滞系统(EMSA)检测这些bZIP蛋白与G-box的结合特性。本论文的主要研究结果如下:
1.目标bZIP基因的分离
利用反转录巢式PCR(NestedRT-PCR)技术,从经ABA处理的水稻14天幼苗总RNA中分离得到4个bZIP基因表达碱性亮氨酸的cDNA片段;
2.bZIP蛋白的酵母单杂交和EMSA分析
酵母单杂交和EMSA分析的结果表明,TRAB1和OSBZ8是两个G-box结合因子,可以在体内,体外条件下分别与G-box元件结合驱动报告基因表达或产生阻滞条带。而OsNIF1和RF2a则无论是在体外或者体外条件下,均未观察到它们与G-box的相互作用;
3.鉴定bZIP蛋白与G-box元件相互作用的关键结构因子
运用DNA定点突变技术,对OsNIF1和RF2a的bZIP区段氨基酸进行改造。同时结合酵母单杂交技术,找到了bZIP蛋白与G-box元件相互识别,相互作用的两个较为关键的结构因子:-25和-10位点上的Arg。
4.bZIP-G-box复合物的分子模拟
利用InsightⅡ软件包。以1DH3为模板,同源模建4个bZIP蛋白与G-box相互作用的三维结构。同时运用Discover模块进行分子力学模拟和优化。进一步解释了这些bZIP蛋白与G-box元件结合形态的异同。
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