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玉米细胞质雄性不育是杂种优势利用的重要种质资源,是研究核质互作的理想材料,具有重要的应用价值。且玉米CMS-C具有抗玉米小斑病T小种和育性相对稳定等优点,但目前CMS-C败育及育性恢复机理还不清楚,这使得CMS-C在杂交制种上的利用受到很大的影响。因此研究玉米CMS-C败育及育性恢复机制具有重要的理论和实践意义。1991年,Dewey等发现CMS-C不育系的线粒体中存在三个特有的嵌合基因atp6-c、atp9-c和cox2-c。而在不育系中嵌合基因atp6-c仅存在一个拷贝,并没有发现正常的atp6基因。而且atp 基因是ATP合成酶复合体上的亚基基因,其发生变异会影响线粒体的能量代谢。但CMS-C材料除了不能产生有正常功能的花粉外其它营养器官均能正常生长,线粒体嵌合基因atp6-c可能与C型不育植株中花粉发育的能量供应不足有关,因此对线粒体基因atp6及atp6-c的研究有助于了解玉米CMS-C的败育机理。课题组前期研究发现在不含atp6基因的不育植株中却能检测到atp6基因的转录本。本实验将以CMS-C中特有嵌合基因atp6-c作为研究对象,以不育系(C48-2、C黄早四),保持系(48-2、黄早四),育性恢复F1(C 黄早四×A619、C48-2×A619、C 黄早四× 自 330、C48-2×18-599),育性保持Fl(C黄早四×18-599、C48-2×自330)为材料,从DNA、RNA及蛋白质水平等方面综合分析atp6基因与CMS-C育性表现的关系。主要研究结果如下:1.通过PCR和RT-PCR分析玉米CMS-C不育系C48-2和C黄早四中是否存在atp6基因及atp6转录本。前期实验分析发现在CMS-C不育系mtDNA中PCR循环数为35时扩增出atp6基因的条带。为了进一步验证这一结果,我们通过不同循环数PCR实验发现PCR循环数为20个时在不育系C48-2和C黄早四中不能扩增出atp6基因,而在25个循环数时却能扩增出浓度较低的目的条带,且随循环数的增加,目的条带的亮度逐渐增加,当循环数为35时其浓度与保持系48-2和黄早四中扩增的浓度基本相同。有研究表明不同循环数的PCR可以检测出线粒体中处于亚化学计量级的基因,即以Sublimon形式存在的基因。由此推测不育系线粒体基因组中atp6基因可能以Sublimon形式存在。通过RT-PCR在玉米CMS-C的花药RNA中也检测到atp6基因的转录本。2.通过对10个供试材料中atp6及atp6-c的qRT-PCR表达分析发现,在玉米花粉发育的四分体时期和单核期,所有的供试材料的不育株中atp6基因的表达量几乎都明显低于可育植株,而atp6-c基因在不育植株四分体时期的表达量几乎都高于育性恢复F1。这与CMS-C花粉的败育时期相符合,表明结构变异基因atp6-c可能与CMS-C的育性变化有关。而且CMS-C育性恢复很可能是通过降低线粒体atp6-c基因的表达量,提高atp6基因的表达来实现的。3.本研究通过荧光素-荧光素酶法测定了 10个供试材料的不同组织中ATP含量,结果发现在花药发育的整个过程中,不育植株中ATP含量都明显低于可育植株,尤其在单核时期表现最明显。且不育植株中ATP含量一般呈现先升高再降低的趋势,不育植株四分体时期的ATP含量达到最高,随后由于ATP含量逐渐降低,使花粉发育所需的能量供应不足,引起花粉败育。除此之外,研究还发现在不育系(C48-2、C黄早四)中atp6基因表达量相对较低的四分体时期和单核小孢子时期,往往伴随着ATP含量的降低,表明atp6表达量的变化可能会影响CMS-C中ATP的合成。在不育系(C48-2、C黄早四)中较高的atp6-c表达量和较低的atp6表达量可能会影响ATP的合成,从而加剧了能量代谢紊乱,导致花粉败育。4.分别以48-2和C48-2的花药单核期线粒体RNA为模板,通过RT-PCR扩增atp6和atp6-c基因,用于构建原核表达载体Atp6-N-28α和Atp6-C-28α。将重组质粒Atp6-N-28cα和Atp6-C-28α分别转入大肠杆菌感受态BL21和Resseta(DE3)中,并利用IPTG诱导目的基因的表达,观察表达产物对菌体生长是否产生影响。实验结果表明含重组质粒Atp6-N-28α和Atp6-C-28α的菌株能正常生长。可能是由于ATP6-C蛋白在大肠杆菌中形成了包涵体,或者ATP6-C蛋白不是毒性蛋白,因此对大肠杆菌生长的影响表现不明显。5.分别以48-2和C48-2的花药单核期线粒体RNA为模板,通过RT-PCR扩增atp6和atp6-c基因,用于构建植物表达载体。本文中共构建了4个植物表达载体,其中两个含有线粒体信号肽的载体ZW-6N-coxⅣ、ZW-6C-coxⅣ,同时构建了两个不含线粒体信号肽的植物表达载体ZW-6N、ZW-6C作为对照。现已将4个重组质粒以及空载体pCAMBIA 1302进行烟草转化实验,下一步将通过对转基因烟草的育性调查分析atp6-c对植物育性表现的影响。