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研究背景与目的: 肺癌是目前世界上发病率最高的恶性肿瘤,主要和直接的致死原因是肿瘤的远处转移。目前认为,上皮来源的恶性肿瘤在转移早期经历了上皮细胞-间质转化(EMT),即肿瘤细胞上皮表型丧失,出现间质细胞或间质来源细胞的表型,表现为细胞间粘附能力降低及细胞侵袭及迁移能力增强。 抑癌基因DAL-1首先在肺腺癌中发现,近年来研究表明,其表达缺失与多种肿瘤转移密切相关,但其在转移中的作用机制至今尚未阐明。细胞免疫荧光检测显示DAL-1蛋白表达于细胞间连接处,与细胞骨架蛋白结合,参与细胞粘附和运动的调节。在肿瘤组织其表达缺失可引起肿瘤细胞间粘附能力下降,侵袭和迁移能力增强,提示DAL-1与EMT的发生有关。我们前期采用免疫组化在人肺癌组织标本中检测发现:DAL-1与E-cadherin表达呈正相关,与Vimentin、Snail表达呈负相关,由此推测DAL-1可能通过调节上皮细胞间质转化过程,影响肺癌的转移。 本研究拟采用基因克隆技术构建过表达DAL-1载体,转染至肺癌A549细胞中,验证DAL-1与EMT的关系;采用双荧光素酶报告基因技术及免疫共沉淀方法研究DAL-1对EMT的调节机制。 方法: 一、采用基因克隆的方法在含DAL-1编码序列的质粒上添加终止密码子,克隆至真核表达载体pcDNA3中,获得重组质粒pcDNA3/DAL-1;经EcoRI、XhoI双酶切后,进行DNA测序鉴定。 二、RT-PCR及Western Blot方法检测7株人肺癌细胞株中DAL-1mRNA和蛋白表达情况,筛选出不表达DAL-1的肺癌A549细胞。将构建的重组质粒pcDNA3/DAL-1转染至A549细胞中,在转录水平和蛋白水平检测DAL-1的表达。 三、脂质体介导重组质粒pcDNA3/DAL-1瞬时转染至肺癌A549细胞中,转染48h后采用荧光定量PCR及Western Blot方法检测过表达DAL-1后E-cadherin、β-catenin、Vimentin、Fibronectin及Snail的mRNA及蛋白表达情况;转染细胞经G418筛选培养2周后,扩大培养获得稳定表达DAL-1的细胞。在转染后第3、4、5周采用荧光定量PCR及Western Blot方法检测DAL-1、E-cadherin、β-catenin、Vimentin、Fibronectin及Snail的mRNA及蛋白表达情况,分析DAL-1与EMT的关系。 四、构建含有E-cadherin启动子片段的荧光素酶报告基因载体,采用双荧光素酶报告基因方法检测DAL-1转染组及空载体组的E-cadherin启动子转录活性,分析DAL-1在转录水平对E-cadherin的调节作用;利用稳定表达DAL-1的肺癌细胞模型,采用免疫共沉淀方法获得在细胞内与DAL-1结合的蛋白质,经SDS-PAGE变性电泳分离后,切取实验组与空载体组的差异蛋白条带经MALDO-TOF/TOF质谱检测,分析DAL-1在蛋白水平对E-cadherin的影响。 结果: 一、重组质粒pcDNA3/DAL-1经双酶切证实插入片段大小与预期一致,测序结果显示终止密码子添加成功,扩增的目的片段完全匹配,成功构建真核表达载体pcDNA3/DAL-1;经RT-PCR、Western Blot检测,证明DAL-1重组质粒能在肺癌A549细胞中高效表达。 二、pcDNA3/DAL-1瞬时转染A549细胞48h后,荧光定量PCR及Western Blot方法检测结果显示:与空载体组相比,实验组E-cadherin mRNA及蛋白表达均显著升高,有统计学差异(P<0.05)。而β-catenin、Vimentin、Fibronectin及Snail在mRNA及蛋白水平与空载体组相比,未见统计学差异(P>0.05)。 三、稳定转染pcDNA3/DAL-1后,荧光定量PCR及Western Blot检测结果显示:与空载体组相比,实验组DAL-1表达显著升高,有统计学差异(P<0.05)。在稳转第3周,转染细胞DAL-1表达达到平台期,此时实验组E-cadherin、β-catenin的mRNA及蛋白表达较空载体组显著升高,有统计学差异(P<0.05);Vimentin的mRNA及蛋白表达较空载体降低,组间有统计学差异(P<0.05);而Fibronectin、Snail的mRNA及蛋白表达与空载体组相比,未见统计学差异(P>0.05)。 四、成功扩增E-cadherin启动子片段,经双酶切证实插入片段的大小及方向均与设计的一致,测序结果与Genbank比对显示完全匹配,成功构建含E-cadherin启动子片段的荧光素酶报告基因质粒。采用双荧光素酶报告基因方法检测,实验组较空载体组的E-cadherin启动子活性显著升高,组间有统计学差异(P<0.05)。 五、免疫共沉淀获得细胞内与DAL-1存在相互作用的蛋白,SDS-PAGE变性电泳后获得差异蛋白条带,经MALDO-TOF/TOF质谱检测分别是4.1B、E-cadherin、HSPA5、P4HA1、β-tubulin,14-3-3ε蛋白结合。 结论: 一、成功构建DAL-1基因的真核表达载体pcDNA3/DAL-1,并证明其在肺癌A549细胞中能够高效表达。 二、首次发现DAL-1通过上调E-cadherin、β-catenin表达,下调Vimentin表达,抑制EMT的发生。 三、DAL-1通过与E-cadherin的启动子结合,在转录水平上调E-cadherin的表达;DAL-1蛋白与E-cadherin蛋白结合,可能通过维持E-cadherin在肺癌细胞膜上表达的稳定性,抑制上皮细胞间质转化,进而抑制肺癌的转移。