【摘 要】
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目的:1.建立名中医治疗验方泻火护心方的指纹图谱,并分析其有效成分。2.建立高糖诱导的H9C2心肌细胞模型,在细胞水平上进一步研究泻火护心方对高糖诱导的H9C2心肌细胞自噬及凋亡的影响。3.初步探讨泻火护心方对高糖诱导的H9C2心肌细胞自噬干预的机制。方法:1、采用HPLC-MS液质联用技术（高效液相色谱法联合质谱分析法）建立泻火护心方指纹图谱,分析该方复方制备液在兔血清及代谢产物中移行的有效成分
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目的:1.建立名中医治疗验方泻火护心方的指纹图谱,并分析其有效成分。2.建立高糖诱导的H9C2心肌细胞模型,在细胞水平上进一步研究泻火护心方对高糖诱导的H9C2心肌细胞自噬及凋亡的影响。3.初步探讨泻火护心方对高糖诱导的H9C2心肌细胞自噬干预的机制。方法:1、采用HPLC-MS液质联用技术（高效液相色谱法联合质谱分析法）建立泻火护心方指纹图谱,分析该方复方制备液在兔血清及代谢产物中移行的有效成分并推测其对应的化学结构。2、体外正常培养基培养H9C2心肌细胞,再分别用不同浓度的高糖液及含药血清进行干预,建立高糖诱导的糖尿病心肌细胞模型。3、SPF级雄性家兔10只,予1.5g/kg泻火护心方汤剂灌胃,每日1次,同时设空白对照组及西药组,同等条件予以等量生理盐水、曲美他嗪灌胃。连续灌服1周后,于灌药后第七天开始给药0.5h、lh、1.5h、2h后采血制备血清。将兔中不同药物血清（泻火护心方含药血清1、泻火护心方含药血2、泻火护心方含药血清3、泻火护心方含药血清4、空白对照生理盐水血清、曲美他嗪西药血清,编码为1、2、3、4、正和西）、不同高糖培养基(高糖型DMEM培养基（25mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、175mmol/L、225mmol/L）及不同标记物（凋亡染料、自噬双标病毒）分别干预H9C2心肌细胞,用实时动态活细胞成像技术观察细胞的增殖、凋亡及自噬状态,并运用蛋白免疫印迹法检测各组中自噬标志蛋白LC3 Ⅱ的含量。结果:本实验研究所建立的复方指纹图谱中确定了 22个共有峰,并通过岛津数据库MetID Solution及质谱分析血中移行成分及代谢产物中11个峰,分别指认为小檗碱（C22H17NO4）、表小檗碱（C20H17NO4）、黄连碱（C19H13NO4）、巴马汀（C21H21NO4）、芦荟大黄素/大黄素（同分异构,C15H1005）、大黄酸（C15H806）、大黄酚（C15H1004）、大黄素甲醚（C16H1205）、桂皮醛（C9H80）、苦杏仁苷（C20H27NO4）、甘草苷（C21H2209）,初步确定了泻火护心方复方中的11种有效成分。通过实时动态活细胞成像平台观察到100mmol/L的高糖环境下稀释100倍的中药血清2促进H9C2心肌细胞增殖过程,抑制了自噬现象发生,并与正常生长的心肌细胞细胞的自噬现象差异显著。100mmol/L的高糖环境稀释100倍中药血清条件和150mmol/L的高糖环境下稀释10倍中药血清均都抑制H9C2心肌细胞增殖的同时,也抑制了其细胞自噬现象,并与正常生长的H9C2心肌细胞的自噬现象差异显著。运用蛋白免疫印迹法检测自噬标志蛋白LC3 Ⅱ,发现LC3 Ⅱ蛋白在中2组（泻火护心方中浓度组）表达较高糖模型组减少（P<0.05）,而与西药对照组比较没有明显差异（P>0.05）,中高低剂量组间没有明显差异（P>0.05）。结论:本实验为通过HPLC-MS液质联用技术研究泻火护心方药物有效成分,所建立的分析条件能够使样品稳定、重复性较好、图谱中各组分的相似度较高,表明此方法建立的指纹图谱准确和可行,为下一步研究该复方的药效物质基础提供了依据。实验还表明,高糖环境下泻火护心方可抑制H9C2细胞增殖,同时抑制自噬现象发生。LC3 Ⅱ表达增加可能是高糖诱导H9C2心肌细胞自噬水平升高,也可能是高糖导致心肌细胞自噬降解异常及产物堆积,而泻火护心方主要通过抑制高糖诱导的H9C2心肌细胞自噬降解,抑制细胞增殖及凋亡,延缓病变的进程。
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