目的：内分泌治疗是激素受体阳性乳腺癌的重要治疗手段，但许多ER阳性的患者在内分泌治疗过程中出现ER转阴，导致获得性耐药，因此对内分泌治疗获得性耐药研究备受关注。对耐药机制的研究在ER水平和信号转导机制的研究则最被重视，内分泌耐药是ER和EGFR家族信号网络的双向作用共同调节的，ER阳性的细胞在MAPK信号表达上调后转为ER阴性。乳腺癌的综合治疗中，内分泌治疗多是序贯于放化疗之后，内分泌治疗过程中也可能伴有乳腺癌干细胞的富集，干细胞的富集是否构成内分泌耐药的原因，如何提高内分泌治疗的疗效，并延缓和逆转内分泌耐药是临床亟待解决的问题。中药β-榄香烯（β-Elemene，β-ELE）是从姜科植物温郁金中提取的抗癌有效成分，临床上应用于多种肿瘤的放疗增敏及化疗辅助，尚有逆转化疗耐药的研究，有报道与内分泌治疗具有协同作用。吉非替尼（Gefitinib，Iressa）是小分子酪氨酸激酶抑制剂，主要应用于肺癌的分子靶向治疗，近年来也应用于乳腺癌的内分泌联合治疗研究。据文献报道，化疗多药耐药逆转的研究中，具有逆转耐药的药物本身与化疗药物具备协同治疗的作用，与内分泌治疗有协同作用的药物是否具备逆转耐药的作用，对此我们进行一系列实验设计。首先，本研究模拟了人体乳腺癌治疗后复发的生物学特点，引入乳腺癌干细胞的概念，即在综合治疗后富集了少量的乳腺癌干细胞，在适当条件下进行增殖分化，导致乳腺癌复发的过程，通过体外干细胞培养条件下培养激素敏感的人乳腺癌MCF-7细胞，检测具备干细胞特性的悬浮球细胞雌激素受体（ER）的表达及对他莫西芬（Tamoxifen，TAM）的治疗敏感性，初步探讨内分泌耐药与乳腺癌干细胞的关系；并同时构建乳腺癌对TAM耐药的MCF-7/TAM细胞株（干细胞培养及传统低剂量诱导的方法），检测耐药细胞中ER在mRNA和蛋白表达水平改变，相关信号转导通路MAPK通路蛋白RAS、MEK1/2、p-ERK1/2水平变化，分析耐药MCF-7对TAM的耐药机制。其次，通过β-ELE、Gefitinib与TAM的联合应用，采用不同给药顺序干预乳腺癌MCF-7细胞的增殖，确定β-ELE和Gefitinib与TAM在内分泌治疗方面的联合应用价值，探索最佳给药顺序，确定其对MCF-7和MCF-7/TAM细胞的低剂量（细胞增殖抑制率<5%）。继而采用低剂量的β-ELE和Gefitinib作为逆转实验的干预剂量，处理对TAM耐药的MCF-7/TAM细胞，通过后者恢复对TAM敏感的现象，进一步检测治疗过程中ERα、ERβ在mRNA和蛋白表达水平的变化，以及MAPK通路蛋白RAS、MEK1/2、p-ERK1/2水平变化，分析β-ELE与Gefitinib在逆转乳腺癌内分泌耐药中的作用及机制。方法：分别于常规培养及干细胞培养条件下（悬浮球培养）培养激素敏感的MCF-7细胞株，流式细胞仪检测分子表型CD44⁺CD24^–/low与CD44⁺CD24⁺亚群细胞比例变化，免疫细胞化学法测定ERα和ERβ的表达变化，MTT法检测细胞对他莫西芬的敏感程度。培养乳腺癌MCF-7/TAM耐药细胞；分别应用TAM与β-ELE联合、TAM与Gefitinib联合作用于MCF-7细胞，设立序贯与混合联用方案，用MTT法检测不同用药顺序对MCF-7细胞的增殖抑制作用，计算二药联合作用指数（combine index，CI），比较不同方案对细胞增殖抑制率的影响，并着重观察ELE和Gefitinib低剂量下TAM对MCF-7细胞的增殖抑制情况。流式细胞仪检测Gefitinib与ELE细胞毒性剂量对MCF-7细胞周期的影响。采用干细胞培养及传统低剂量诱导的方法构建出ERα阴性的乳腺癌TAM耐药细胞MCF-7/TAM，分别不同剂量和不同时间段β-ELE和Gefitinib处理MCF-7/TAM细胞，通过MTT法分析并确定β-ELE和Gefitinib对MCF-7/TAM和对MCF-7细胞的低剂量及最佳作用时间，据MTT结果用10ug/ml的β-ELE和Gefitinib处理MCF-7/TAM细胞48h，设立MCF-7组（M0），MCF-7/TAM组（M/T），MCF-7/TAM-ELE10ug/ml（E10），MCF-7/TAM-Gefitinib10ug/ml（G10）组进行后续试验，用MTT方法检测经处理后的E10与G10组细胞对TAM的敏感性，RT-PCR和免疫细胞化学观察ERα和ERβ在mRNA和蛋白水平的变化，并检测各组细胞MAPK通路RAS，MEK1/2、p-ERK1/2蛋白水平变化。实验结果应用SPSS16.0软件，计数资料ERα与ERβ的阳性表达采用卡方检验进行统计学分析，结果用百分率表示；凝胶电泳结果分析采用IMAGEJ与LabWorks4.6软件分析，计量资料确保符合正态分布，两组样本比较采用t检验，三组IC50值采用方差分析，结果以均数±标准差表示，P＜0.05为差异有统计学意义。结果：干细胞培养条件下CD44⁺CD24^–/low亚群细胞所占比例由常规培养的（0.27±0.08）%增至（1.60±0.08）%（p＜0.05），而CD44⁺CD24⁺亚群细胞比例由（5.59±0.88）%增至（30.63±4.40）%（p＜0.05）。干细胞培养条件培养下ERα和ERβ表达率较常规培养下调，分别由85.27%和90.53%降至69.43%和73.20%，差异有统计学意义（p均＜0.05），且对他莫西芬的敏感性降低，IC50值由（9.82±0.31）umol/L升至（16.46±0.50）umol/L，再次诱导分化后ER并未出现上调，对他莫西芬的敏感性仍旧降低（p＜0.05）。TAM与β-ELE序贯联用具有协同作用，序贯方法优于混合应用的叠加作用（p＜0.05）。TAM与Gefitinib联用不同顺序均具有协同作用，序贯联用方法优于混合应用（p＜0.05）。β-ELE5ug/ml及10ug/ml时ELE--TAM显示出优于TAM--ELE方案的趋势， Gefitinib5ug/ml及10ug/ml时Gefitinib--TAM显示出优于TAM--Gefitinib方案的趋势。流式细胞仪检测显示，β-ELE20ug/ml及40ug/ml作用于MCF-7细胞后，G0/G1期细胞比例由49.26%提高到64.04%和63.88%；Gefitinib10ug/ml及20ug/ml作用于MCF-7细胞后，G0/G1期细胞比例由49.26%提高到54.89%，68.35%。确定了β-ELE与Gefitinib与TAM的可联合性。后续试验发现，10μg/ml的β-ELE与Gefitinib作为干预剂量作用于M/T细胞48h后，细胞可重新对TAM敏感，细胞增殖受到抑制，实现耐药逆转。RT-PCR检测发现β-ELE治疗后可上调MCF-7/TAM细胞中ERα mRNA表达水平。与M0组相比，M/T组ERα mRNA与ERβ mRNA水平均见下调，以ERα mRNA下调最为显著（p＜0.05）。经β-ELE治疗后，E10组ERα mRNA明显上调（p＜0.05），ERβ mRNA也在E10组出现上调（p＜0.05）。M0、M/T、E10各组ERα表达率分别为（95.04±1.81）%、（2.10±0.24）%、（82.34±3.21）%；各组ERβ表达率（96.13±1.07）%、（85.13±2.17）%、（74.33±3.07）%。ERα在M/T组细胞中的表达率显著下降p＜0.05)，在经过β-ELE治疗后表达率再次升高（p＜0.05）。而ERβ在M/T组细胞中的表达率仅有轻度下降（p＞0.05），应用β-ELE治疗后表达率呈下降趋势。Western blot分析结果显示，M/T组MAPK通路蛋白Ras、MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表达水平均较M0组明显增强（p＜0.05），经10μg/ml的β-ELE治疗48h后Ras、MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表达水平均较M/T组下调（p＜0.05）。在Gefitinib实验中，我们发现，Gefitinib上调MCF-7/TAM细胞中ERα mRNA和ERβ mRNA的水平，与M0组相比，M/T组ERα mRNA与ERβmRNA水平均见下调，以ERα mRNA下调最为显著（p＜0.05）。但是经Gefitinib治疗后，G10组ERα mRNA明显上调（p＜0.05），ERβ mRNA也在G10组出现上调（p＜0.05）。免疫细胞化学显示，M0、M/T、G10各组ERα表达率分别为（95.04±1.81）%、（2.10±0.24）%、（75.04±2.88）%；各组ERβ表达率（96.13±1.07）%、（85.13±2.17）%、（90.25±2.15）%。ERα在M/T组细胞中的表达率显著下降（p＜0.05），在经过Gefitinib治疗后表达率再次升高（p＜0.05）。而ERβ在M/T组细胞中的表达率仅有轻度下降（p＞0.05），应用Gefitinib治疗后表达率呈上调趋势。Western blot分析结果显示，M/T组MAPK通路蛋白Ras、MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表达水平均较M0组明显增强（p＜0.05），经10μg/ml的Gefitinib治疗48h后Ras、MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表达水平均较M/T组下调（p＜0.05）。结论：1.干细胞培养条件下可培养出具备干细胞特性的细胞亚群的悬浮球，且ER为阳性表达，但对TAM治疗敏感性减低，提示乳腺癌干细胞的富集可能是内分泌耐药的原因之一。2.利用干细胞培养方法可以构建乳腺癌MCF-7细胞的TAM耐药细胞。耐药的主要原因可能与MAPK通路蛋白表达上调，导致ERα缺失有关。3. β-ELE与Gefitinib均可阻滞MCF-7细胞于G0/G1期，增强TAM的抑制细胞增殖作用，与TAM药物间有协同作用。4. β-ELE和Gefitinib通过上调ERα mRNA水平，使ERα受体再表达，恢复对TAM的治疗敏感性，逆转MCF-7细胞对TAM耐药。5. MAPK通路是ERα受体再表达的重要途径，β-ELE和Gefitinib可以通过下调MAPK通道蛋白表达而实现ERα受体再表达。