结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是常见的消化系统恶性肿瘤,其发病率位居男性恶性肿瘤的第三位及女性恶性肿瘤的第二位。全球男性CRC每年新发病例高达近75万,每年约37万男性死于CRC,CRC死亡率居男性癌症死亡率第四位。全球女性CRC每年新发病例高达61万,每年32万女性死于CRC,CRC死亡率居女性癌症死亡率第三位。CRC已成为严重危害人类健康的疾病,受到各国卫生机构的重视。目前只有早期发现及根治性结直肠癌手术可以治愈该病。然而,一部分CRC患者在首次就诊时已伴有远处转移,处于结直肠癌晚期,无法手术根治。晚期CRC的治疗方法包括局部放疗、全身化疗、中医药治疗及靶向药物治疗。局部放疗及全身化疗副作用大,而且疗效有限。目前常用的CRC化疗方案为5-氟尿嘧啶、依立替康、甲酰四氢叶酸、奥沙利铂、卡培他滨组成的联合化疗方案。在全身化疗治疗过程中CRC常出现耐药,并导致治疗失败。随着对CRC发病机制研究的深入,多种CRC治疗靶点被发现。靶向药物治疗已成为新的有前途的肿瘤治疗方法,具有精准、安全及损伤小等特点,逐步成为晚期CRC治疗的理想选择方案,并可以作为化疗的联合方案。血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)抑制剂贝伐珠单抗及表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)抑制剂西妥昔单抗已被成功用于晚期CRC的治疗。然而,CRC的发生及发展是多信号通路的,阻断单一信号通路后肿瘤其他信号通路常发生代偿,贝伐珠单抗及西妥昔单抗治疗的CRC患者中仍然存在肿瘤耐药发生。研究CRC其他的信号通路不仅有利于进一步明确CRC发病机制,而且有助于发现新的晚期CRC治疗靶点。如果能将新的靶向药物应用于临床将有助于进一步改善CRC患者的预后。环氧化酶(cyclooxygenase,COX)是前列腺素(prostaglandins,PG)合成的限速酶,COX将花生四烯酸转化为PGG2,PGG2进一步被转化为PGH2,PGH2进而生成具有生物活性的PG(PGE2、PGD2和血栓素A2等),在炎症、应激及消化道黏膜保护等生理过程中发挥重要作用。在生物体内,COX存在COX-1、COX-2、及COX3三种同工酶。COX-1为结构性酶,主要存在于血管、胃和肾等组织中,参与胃黏膜保护、血流调节及血小板聚集调节等生理功能。COX-3为COX-1的剪接变异体,目前其功能尚不清楚。与COX-1结构性表达不同,COX-2在组织损伤及炎症时表达增加,COX-2是典型的诱导型COX。研究发现超过50%的肿瘤组织COX-2高表达,这表明COX-2在肿瘤发生过程中具有重要作用,是重要的促肿瘤因子。COX-2的产物PGE2通过G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor,GPCR)家族的EP1、EP2、EP3、EP4及过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors,PPAR)作用于细胞膜,进而将信号传导入细胞内。研究表明,PGE2通过EP4激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)和蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)抑制细胞凋亡,进而促进细胞增殖。PGE2还可以激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路,进而促进肿瘤生长。PGE2也可以诱导抗凋亡蛋白Bcl-2表达,并增加核转录因子kappa B(nuclear factor kappa B,NF-ΚB)活性,进而抑制凋亡,促进肿瘤发生。同时,COX-2还具有促进血管生成的作用。COX-2诱导细胞产生血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),VEGF能够促进血管内皮细胞迁移,进而促进血管生成。还有研究表明,COX-2通过调控EP4介导的NOTCH/WNT通路诱导肿瘤干细胞发生。肿瘤微环境的免疫功能常常发生由Th1主导的免疫反应向由Th2主导的免疫反应转换。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)和白介素-2(interleukin-2,IL-2)可以促进Th1细胞增殖,而白介素-4(interleukin-4,IL-4)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)和白介素-10(interleukin-10,IL-10)促进Th2细胞增殖。COX-2通过PGE2下调肿瘤细胞TNF-α、IFN-γ和IL-2表达,并上调肿瘤细胞IL-4、IL-6和IL-10表达,进而促进肿瘤微环境免疫反应转换,使肿瘤逃避机体免疫监控。可见,COX-2可以通过促进细胞生长、抑制凋亡、促进肿瘤干细胞形成及促进肿瘤免疫逃避促进肿瘤发生,COX-2是重要的促肿瘤因子,可以作为肿瘤治疗靶点。X线修复交叉互补蛋白5(X-ray repair cross-complementing protein 5,XRCC5)亦称为Ku80,由XRCC5基因编码,与XRCC6共同构成XRCC5/XRCC6异源二聚体,是一种DNA依赖性蛋白激酶复合物(DNA-dependent protein kinase complex,DNA-PK)。XRCC5基因位于2q33-34,编码732个氨基酸,XRCC5蛋白分子质量约为86k Da。研究证实,XRCC5蛋白参与DNA双链断裂修复和重组,维持染色体及基因组稳定性。XRCC5/XRCC6二聚体可以结合DNA双链断裂末端,是DNA非同源末端连接修复的必要组分。研究还表明,XRCC5的功能并不局限于DNA双链断裂修复,XRCC5还可以作为粘附因子,参与肿瘤细胞的粘附、迁移及侵袭。XRCC5在多种肿瘤组织中高表达(包括结直肠癌),这表明XRCC5也是一种促癌因子,参与肿瘤发生发展。既往研究表明,XRCC5可以通过与CBP协同作用增加COX-2表达促进肺癌细胞的增殖。然而,XRCC5与COX-2在结直肠癌发生发展中的相互作用及其机制尚不明确。本研究通过生物素-链霉亲和素垂钓实验寻找并鉴定结肠癌细胞中COX-2表达调控中未知的且必须的转录因子时,发现XRCC5能够特异性地结合在COX-2启动子上,进而激活COX-2转录,上调COX-2表达。通过调控XRCC5在结肠癌细胞中的表达,验证XRCC5对COX-2的调控作用。通过细胞增殖实验及动物成瘤实验验证XRCC5通过COX-2影响结肠癌生长。为进一步明确XRCC5调控COX-2的机制,我们通过进一步的免疫共沉淀实验还发现转录共活化子p300参与XRCC5调控COX-2的表达过程。而后,我们还验证了p300通过调控XRCC5乙酰化水平进而调控COX-2表达的机制。我们的研究阐明了XRCC5及p300协同调控COX-2促进CRC生长的机制,为XRCC5成为CRC治疗靶点提供了理论及实验依据。第一部分XRCC5作为COX-2启动子区结合蛋白调控结肠癌细胞中COX-2表达目的:在结肠癌细胞中通过生物素-链霉亲和素垂钓实验寻找并鉴定与COX-2启动子区特异性结合的调节蛋白,并验证该调节蛋白对结肠癌细胞COX-2表达的影响。方法:为了鉴定潜在的COX-2启动子区特异性结合蛋白,我们设计了一段478bp(-30至-508)生物素标记的双链DNA探针。应用生物素-链霉亲和素垂钓实验在四种结肠癌细胞系(RKO、LoVo、DLD-1和SW480)中分离出COX-2启动子区特异性结合蛋白复合物。对该蛋白复合物进行洗脱沉淀,采用SDS-PAGE及银染显色显示可能的COX-2启动子区特异性结合蛋白条带。对可能的条带进行酶解,并应用质谱分析及蛋白质数据库比对鉴定蛋白。通过RT-PCR及Western blot判断发现的蛋白及COX-2在四种结肠癌细胞中的表达情况。在LoVo细胞中,通过转染技术应用si RNA敲低该鉴定出的蛋白表达水平,并共转染COX-2启动子驱动的荧光素酶报告基因,进而验证该鉴定出的蛋白对COX-2启动子区的特异性结合作用及敲低该蛋白对COX-2启动子区激活的抑制作用。在上述共转染体系中,通过LPS诱导COX-2表达,进而验证COX-2诱导剂是否可以拮抗敲低该蛋白对COX-2启动子区激活的抑制作用。在LoVo及RKO细胞中,应用免疫荧光定位实验确定该鉴定的蛋白是否位于细胞核,进一步验证该鉴定的蛋白是否在COX-2转录过程中扮演转录因子角色。在LoVo及RKO细胞中,通过si RNA敲低该蛋白表达,通过质粒转染上调该蛋白表达,并应用Western blot鉴定COX-2蛋白表达变化,进一步验证该蛋白对COX-2蛋白表达的影响。结果:1.生物素-链霉亲和素垂钓实验分离出COX-2启动子区特异性结合蛋白复合物,经SDS-PAGE及银染发现分子量约90k D的蛋白条带。质谱分析及蛋白质数据库比对鉴定出该蛋白为XRCC5。2.RT-PCR及Western blot提示四种结肠癌细胞系中XRCC5及COX-2在转录水平及蛋白水平均呈高表达。3.在LoVo细胞中,敲低XRCC5表达明显降低其对COX-2启动子区的激活作用。COX-2诱导剂LPS拮抗敲低XRCC5表达对COX-2启动子区激活的抑制作用。4.在LoVo及RKO细胞中,应用免疫荧光定位实验确定XRCC5位于细胞核。5.在蛋白表达水平,敲低XRCC5明显降低COX-2蛋白表达水平,而上调XRCC5表达明显升高COX-2蛋白表达水平。XRCC5对COX-2表达具有正调控作用。结论:在结肠癌细胞中,XRCC5是特异性的COX-2启动子区结合蛋白;XRCC5与COX-2启动子区结合可以激活COX-2启动子,并促进COX-2转录。结肠癌细胞中XRCC5在转录水平及蛋白水平均呈高表达,XRCC5是结直肠癌的促癌因子。XRCC5在蛋白水平对COX-2具有调控作用,且该调控作用为正向调控。第二部分转录共活化子p300通过乙酰化XRCC5协同调控结肠癌细胞中COX-2表达目的:通过免疫共沉淀方法探讨XRCC5与转录共活化子p300是否存在相互作用。通过调控p300在结肠癌细胞中的水平及其乙酰化功能,进一步明确p300是否通过乙酰化XRCC5协同调控COX2表达。方法:提取RKO、LoVo及SW480结肠癌细胞核蛋白,应用XRCC5抗体进行免疫共沉淀,分离出含有XRCC5的免疫复合物,应用Western blot检测p300抗体是否与该免疫复合物结合。同时,应用p300抗体进行免疫共沉淀,分离出含有p300的免疫复合物,应用Western blot检测XRCC5抗体是否与该免疫复合物结合。通过上述实验验证XRCC5蛋白与p300蛋白是否存在相互作用。应用免疫荧光定位实验确定XRCC5与p300是否位于细胞核同一位置,进一步验证两者的相关性。通过Western blot检测RKO、LoVo及SW480结肠癌细胞核蛋白乙酰化XRCC5表达情况。通过转染p300过表达质粒上调p300表达,利用p300乙酰化酶抑制剂C646抑制p300乙酰化作用。而后,应用乙酰化抗体免疫共沉淀核蛋白,利用Western blot检测该免疫复合物中XRCC5及乙酰化XRCC5的表达,验证P300对XRCC5乙酰化的作用。对结肠癌细胞上调p300表达或应用C646抑制p300乙酰化作用,Western blot检测COX-2表达情况,验证p300乙酰化XRCC5对COX-2表达的调控作用。结果:1.应用XRCC5抗体进行免疫共沉淀得到的免疫复合物可以检测到p300蛋白。而应用p300抗体进行免疫共沉淀得到的免疫复合物可以检测到XRCC5蛋白。2.免疫荧光定位实验表明,XRCC5蛋白与p300蛋白均在结肠癌细胞核内表6达,两者位置一致。3.RKO、LoVo及SW480结肠癌细胞核蛋白中均存在大量的乙酰化XRCC5表达。上调p300表达并不增加XRCC5表达,但可以增加XRCC5乙酰化水平,而抑制p300乙酰化作用则降低XRCC5乙酰化水平。上调p300表达可以增加COX-2表达,而抑制p300乙酰化作用则降低COX-2表达。结论:XRCC5与转录共活化子p300在结肠癌细胞核内存在相互作用,p300通过乙酰化XRCC5协同调控结肠癌细胞COX-2表达。第三部分XRCC5及p300协同调控COX-2表达促进结肠癌细胞增殖及肿瘤生长目的:通过细胞增殖实验及动物成瘤实验探讨XRCC5调控COX-2促进结肠癌生长的作用。通过调控XRCC5及p300乙酰化功能,验证XRCC5及p300协同调控COX-2并影响结肠癌细胞增殖的作用。方法:在LoVo及RKO细胞中,通过si RNA敲低XRCC5表达,应用MTS方法鉴定结肠癌细胞活力,应用克隆形成实验鉴定结肠癌细胞增殖能力,通过显微镜观察细胞形态学变化,研究敲低XRCC5表达对结肠癌细胞生长的影响。通过转染XRCC5过表达质粒上调XRCC5表达,采用MTS方法鉴定结肠癌细胞活力,明确上调XRCC5对结肠癌细胞生长的作用。在LoVo及RKO细胞中,通过转染XRCC5过表达质粒上调XRCC5表达,应用MTS方法判定结肠癌细胞活力,证明XRCC5对结肠癌生长的促进作用。而后,应用COX-2抑制剂塞来昔布抑制COX-2表达,通过MTS实验鉴定结肠癌细胞活力,明确COX-2抑制剂是否具有拮抗XRCC5促进结肠癌生长的作用,进而在体外验证XRCC5通过调控COX-2影响结肠癌生长。应用裸鼠成瘤实验,研究si RNA敲低XRCC5表达对结肠癌在裸鼠体内生长的抑制作用,并观察COX-2诱导剂LPS是否可以拮抗该抑制作用,进而在动物中验证XRCC5通过调控COX-2影响结肠癌生长。上调结肠癌细胞p300表达,应用MTS观察结肠癌细胞活力,验证p300对结肠癌细胞生长的促进作用。同时上调p300表达和敲低XRCC5表达,应用MTS观察结肠癌细胞活力,研究敲低XRCC5拮抗p300的促进结肠癌细胞生长的作用,证明p300通过XRCC5影响结肠癌细胞生长。同时抑制p300乙酰化作用和上调XRCC5表达,应用MTS观察结肠癌细胞活力,验证p300乙酰化抑制剂拮抗XRCC5促进结肠癌细胞生长的作用,证明p300通过乙酰化XRCC5促进结肠癌细胞生长。结果:1.MTS实验表明,通过si RNA敲低XRCC5表达可以明显抑制结肠癌细胞活力,而转染XRCC5过表达质粒上调XRCC5表达可以明显增加结肠癌细胞活力。2.显微镜细胞形态学观察表明,经si RNA敲低XRCC5表达后,结肠癌细胞贴壁减少,细胞碎片增多。克隆形成实验表明,通过si RNA敲低XRCC5表达可以明显降低结肠癌细胞克隆形成能力。3.转染XRCC5过表达质粒可以促进结肠癌细胞生长,COX-2抑制剂塞来昔布可以拮抗XRCC5促进结肠癌生长的作用,这在体外证明了XRCC5通过COX-2促进结肠癌细胞生长。4.裸鼠成瘤实验表明,si RNA敲低XRCC5表达可以抑制结肠癌生长,而应用COX-2诱导剂LPS可以拮抗该抑制作用,这在体内证明了XRCC5通过COX-2促进结肠癌生长。5.上调p300表达明显促进结肠癌细胞生长。敲低XRCC5可以拮抗p300促进结肠癌细胞生长的作用。抑制p300乙酰化作用同样可以在一定程度上拮抗XRCC5的促进结肠癌细胞生长的作用。这表明p300通过乙酰化XRCC5促进结肠癌细胞生长。结论:体内实验及体外实验表明,XRCC5通过COX-2促进结肠癌生长。而p300则通过乙酰化XRCC5促进结肠癌细胞生长。p300通过对XRCC5的乙酰化作用与XRCC5协同调控COX-2表达,进而影响结肠癌生长。我们的实验结果为XRCC5成为CRC治疗靶点提供了理论及实验依据。