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目的:
通过复制糖尿病(DM)大鼠模型,研究胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂exenatide对DM大鼠血管内皮损伤的影响;并进行离体内皮细胞培养,采用高糖和同型半胱氨酸(Hcy)刺激内皮细胞,进一步探讨exenatide对内皮细胞的保护作用,为临床糖尿病血管病变的防治提供新思路,为exenatide的实际应用提供实验依据与基础。
方法:
动物实验:43只清洁级健康成年雄性Wistar大鼠,随机分为:空白对照组(vehicle)和高脂组(fatdiet,FD)。FD组大鼠脂肪乳灌胃14天,进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)和空腹胰岛素水平(Fins)的检测,之后腹腔注射链脲佐菌素(STZ)复制DM模型,以空腹血糖≥11.8mmol/L作为模型成功标志。将DM模型随机分为:糖尿病组(DM);小剂量exenatide治疗组(Emin,0.3125μg/天);大剂量exenatide治疗组(Emax,0.625μg/天)和罗格列酮治疗组(RSG)。药物治疗45天。检测大鼠空腹血糖(FG);小动物超声成像系统检测大鼠腹主动脉血流速;制作离体胸主动脉环,观察动脉环对不同浓度去甲肾上腺素(NE)、乙酰胆碱(Ach)和硝普钠(SNP)的舒缩反应;HE染色法和血管性假血友病因子(vWF)免疫组织化学法观察胸主动脉形态学改变;扫描及透射电镜观察胸主动脉内皮细胞的超微结构改变。WesternBlot法和免疫组织化学法检测胸主动脉组织GLP-1受体表达。
细胞实验:胶原酶消化法原代培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),免疫荧光法检测内皮细胞MarkereNOS及VE-cadherin的表达,选用2～4代细胞用于实验。分别采用高糖(10mmol/L)或Hcy(500μmol/L)刺激HUVECs48小时,建立内皮细胞损伤模型,观察exenatide单体exendin-4(0.003,0.03,0.3μmol/L)预干预对高糖或Hcy内皮损伤模型细胞存活率(MTT法),细胞上清液中的LDH活性(比色法)及细胞凋亡情况(TUNEL)的影响。
结果:
动物实验:脂肪乳灌胃14天后FD组大鼠OGTT各时间点血糖水平、葡萄糖曲线下面积(AUC)均较vehicle组明显升高,Fins、稳态模式评价胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)较vehicle组明显升高,提示高脂饮食喂养大鼠出现了明显的糖代谢紊乱和胰岛素抵抗现象;联合小剂量STZ两次腹腔注射诱导DM模型,DM组大鼠FG水平较vehicle组明显升高,≥11.8mmol/L,提示DM模型成功建立。Exenatide两种剂量治疗均能明显降低DM大鼠FG水平;提高DM大鼠腹主动脉血流速度;显著改善DM引起的Ach介导的内皮依赖性血管舒张功能损伤,对DM引起的SNP介导的非内皮依赖性血管舒张功能下降无明显影响,各组大鼠胸主动脉对NE诱导的收缩反应无明显差异;exenatide可以明显减轻DM大鼠胸主动脉的内皮损伤和内皮vWF表达量减少,以及血管内皮细胞超微结构的异常改变,exenatide的上述保护效应与对照药物罗格列酮作用相似。三治疗组之间无明显统计学差异。此外,exenatide治疗能显著上调DM大鼠血管组织GLP-1受体的表达。
细胞实验:Exendin-4能明显改善高糖或Hcy诱导的HUVECs存活率的降低,减轻内皮细胞皱缩、变圆以及染色质分割成块状/凋亡小体等异常改变,减少细胞凋亡;同时降低Hcy诱导的内皮细胞上清液中的LDH活性,减轻细胞坏死。
结论:
本研究发现exenatide治疗能够降低DM大鼠血糖水平,并改善糖尿病血管内皮结构和功能的损伤,提高血管组织GLP-1受体的表达;离体细胞实验研究表明exenatide单体exendin-4预干预可减轻高糖或Hcy诱导的内皮细胞损伤,提示exenatide对内皮细胞有直接的保护作用。