【摘 要】
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L-半胱氨酸是一种重要的含巯基的氨基酸,在医药、化工和食品加工等行业有着广泛应用。目前主要通过毛发分解提取法和化学合成法制备L-半胱氨酸。然而,这些方法存在过程复杂、产率低和环境污染等问题。微生物发酵法具有绿色环保等诸多优点,近年来已经成为生产各种氨基酸的首选工艺;但是,目前微生物发酵法生产L-半胱氨酸的产量还较低,推测其主要原因是合成L-半胱氨酸的前体L-丝氨酸不足。本论文以实验室前期构建的产L
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L-半胱氨酸是一种重要的含巯基的氨基酸,在医药、化工和食品加工等行业有着广泛应用。目前主要通过毛发分解提取法和化学合成法制备L-半胱氨酸。然而,这些方法存在过程复杂、产率低和环境污染等问题。微生物发酵法具有绿色环保等诸多优点,近年来已经成为生产各种氨基酸的首选工艺;但是,目前微生物发酵法生产L-半胱氨酸的产量还较低,推测其主要原因是合成L-半胱氨酸的前体L-丝氨酸不足。本论文以实验室前期构建的产L-丝氨酸的大肠杆菌4WG和谷氨酸棒杆菌A36为研究对象,对其L-半胱氨酸合成途径关键酶、转运蛋白、降解途径进行改造,构建了产L-半胱氨酸的重组菌株,并对重组谷氨酸棒杆菌进行硫源优化,提高了重组谷氨酸棒杆菌发酵生产L-半胱氨酸的性能。主要研究结果如下:（1）以实验室前期构建的产L-丝氨酸(2.01 g·L-1)的大肠杆菌4WG为出发菌株,通过加强表达L-半胱氨酸合成途径关键酶编码基因cys E和转运途径关键酶编码基因yde D,以及敲除降解途径关键酶编码基因tna A,构建了利用甘油产L-半胱氨酸的4WG-Eccys EFr、4WG-Eccys EFr-yde D和4WG-Δtna A-Eccys EFr、4WG-Δtna A-Eccys EFr-yde D四株重组菌;其中4WG-Δtna A-Eccys EFr-yde D的产量最高,发酵48 h时,L-半胱氨酸的产量达到313.4 mg·L-1;与仅加强表达L-半胱氨酸合成途径关键酶的菌株4WG-Eccys EFr相比,产量提高了1.3倍,而出发菌株大肠杆菌4WG不积累L-半胱氨酸。（2）以实验室前期构建的高产L-丝氨酸(30.57 g·L-1)的谷氨酸棒杆菌A36为出发菌株,通过加强表达来源于大肠杆菌解除反馈抑制的L-丝氨酸-O-乙酰基转移酶（cys E编码）,构建了重组菌S-C-1;加强表达来源于拟南芥中的cys EFr,构建了重组菌S-C-2;在菌株S-C-1和S-C-2中加强表达OAS巯基化酶-A（cys K编码）,构建了菌株S-C-3和S-C-4。对四株重组菌进行发酵评价,发现与菌株S-C-1和S-C-2相比,菌株S-C-3和S-C-4 L-半胱氨酸的产量分别下降17.8%和65.5%。为进一步提高L-半胱氨酸产量,在菌株S-C-1和S-C-2中加强转运途径关键酶（bcr编码）,构建了菌株S-C-5和S-C-6;在菌株S-C-1、S-C-2、S-C-5和S-C-6中敲除L-半胱氨酸降解途径关键酶（aec D编码）,构建了菌株S-C-7、S-C-8、S-C-9和S-C-10。对获得的重组菌进行发酵评价,结果表明,S-C-7 L-半胱氨酸产量最高,为286.7 mg·L-1。（3）通过优化硫源进一步提高菌株S-C-7 L-半胱氨酸的产量,结果表明,最佳硫源为硫代硫酸钠（Na2S2O3）,发酵24 h时添加12 g·L-1Na2S2O3,L-半胱氨酸的产量最高,为581.6 mg·L-1,较优化前提高1.0倍。最后,在5 L发酵罐中对S-C-7进行发酵评价,L-半胱氨酸产量达到1.2 g·L-1,是目前报道的谷氨酸棒杆菌产L-半胱氨酸的最高产量。
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