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[背景及目的]：
结肠癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，居我国因肿瘤而致死亡原因的第四位，而且发病率有逐年上升的趋势。尽管当前的常规治疗手段，包括手术及放疗、化疗能在一定程度上缓解患者的痛苦，延长其寿命，但总的治疗效果还是不能让人满意。因此，迫切需要发展或联合新的治疗方法或新的治疗策略。
以往的研究结果表明，肿瘤新生血管的形成不仅与结肠癌细胞的生长、增殖关系密切，而且与癌细胞的远处器官的转移也紧密相关，并可作为结肠癌治疗的一个独立的预后因素。因此，针对肿瘤新生血管的形成己成为目前结肠癌治疗中的一个新靶点。
肿瘤新生血管的形成受多种因素的影响，其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前已知的最强的血管生成促进因子，它通过与其相应受体Flt-1(fms-like tyrosine kinase-1，Flt-1)及Flk-1／KDR(fetal liver kinase-1，Flk-1／kinase insert domain-containing receptor,KDR)相结合是发挥其促血管生成的功能，其中Fit-1与VEGF的亲和力比Flk-1高7-10倍。据报道，VEGF在正常肠上皮细胞中不表达或极低表达，与之相反，对结肠癌肿瘤标本的研究显示，VEGF在癌组织中高表达，结肠癌细胞可分泌大量的VEGF；进一步的研究显示，VEGF在癌组织中的表达水平与患者TMN分期以及预后密切相关。这些研究为下一步针对VEGF及其受体为靶点的治疗打下了良好的理论基础。
可溶性Flt-1(soluble Flt-1，sFlt-1)是一种体内天然存在的、低表达丰度的VEGF拮抗剂，是内源性表达的Flt-1的剪切形式。sFlt-1缺少Flt-1的跨膜部分和胞内部分，与VEGF结合后，不具备酪氨酸激酶的活性，可以抑制VEGF的促血管生成的生物学功能。已有研究证实，sFlt-1的第1-3个Ig样结构区域为与VEGF结合所必需，且等同于全长sFlt-1与VEGF的结合能力。应用sFlt-1对抗血管生成，是治疗肿瘤是理想的选择。
基于以上所述，VEGF及其受体在结肠癌的发生、发展中起着重要的作用。针对VEGF及sFlt-1为靶点治疗结肠癌有着光明的前景。本研究针对sFlt-1这种天然存在的强大的VEGF拮抗剂，体外克隆构建sFlt-1的第1-3个Ig样结构区域，将其与真核载体pcDNA3.0连接后，转染结肠癌LoVo细胞，探讨其对结肠癌LoVo细胞生长增殖的影响。
[研究方法]：
1.应用RT-PCR的方法从人脐血静脉内皮细胞中扩增sFlt-1基因的第1-3个Ig样结构区域，并将其克隆至TA载体中。对TA克隆中的sFlt-1基因进行酶切及PCR鉴定，并测序。阳性克隆命名为T-sFlt。
2.应用PCR的方法从T-sFlt质粒扩增sFlt-1基因，并将其与真核载体pcDNA3.0连接，构建真核重组质粒pcDNA-sFlt。应用酶切鉴定、PCR、DNA测序的方法，对重组体进行鉴定。
3.通过脂质体Lipofectamine 2000介导重组体pcDNA-sFlt转染结肠癌LoVo细胞。对转染后筛选出的阳性细胞克隆，应用RT-PCT的方法检测sFlt-1 mRNA的表达，应该ELISA的方法检测sFlt-1蛋白的表达。
4.应用MTT法检测转染后的细胞上清对LoVo细胞生长情况的影响，同时用ELISA法检测不同转染时间段LoVo细胞上清中VEGF浓度的变化。
[实验结果]：
1.以RT-PCR的方法从人脐血静脉内皮细胞中成功扩增出大小约1000bp的DNA片段；其与TA克隆载体连接后，经酶切及PCR鉴定，电泳结果表明有目的基因片段的插入；对T-sFlt重组质粒进行测序鉴定，测序结果同GenBank上的Flt-1的基因序列进行比对，完全吻合，未发现任何碱基突变。
2.以PCR的方法从T-sFlt重组质粒中成功扩增出大小约1000bp的DNA片段，与预计相符；PCR产物与真核载体pcDNA3.0连接后，经酶切及PCR鉴定，显示有目的基因片段的插入；对pcDNA-sFlt重组质粒进行测序鉴定，测序结果与GenBank上的Flt-1的基因序列进行比对，完全吻合，未发现碱基突变。
3.pcDNA-sFlt重组质粒转染结肠癌LoVo细胞后RT-PCR检测目的基因mRNA表达，电泳可见目的基因条带，说明有转录水平上的表达。ELISA检测到细胞培养上清中sFlt-1重组蛋白，说明转染后的LoVo细胞能表达sFlt-1并将其分泌到上清中，分泌量48小时达到高峰。
4.各转染时段的细胞培养上清液均能抑制LoVo细胞的生长，说明重组蛋白具有生物学活性。其中转染48小时的上清液作用最明显，抑制作用与蛋白分泌量结果相符。ELISA检测细胞培养液上清VEGF浓度显示，实验组培养液上清中的VEGF浓度均有所降低。
[结论]：
成功克隆sFlt-1基因的第1-3个Ig样区域，构建pcDNA-sFlt真核表达载体并转染结肠癌LoVo细胞，并获得具有生物学活性的重组sFlt-1蛋白，为下一步的动物实验打下了基础。