研究背景原发性高血压是临床常见病和多发病,是引发心、脑血管和肾病变的一个重要的危险因素。血管重构(Vascular remodeling, VR)是高血压靶器官损害的病理基础,发掘和研究能对抗和逆转VR的抗高血压药物具有重大意义。血管外膜是最早发生病理变化的血管结构,是VR的重要参与者,近年来发现其对高血压的反应较血管内膜和中膜更为敏感。血管外膜的主要细胞类型是外膜成纤维细胞(Adventitial fibroblast, AF),在系统调节机制作用下,成为参与VR的重要细胞。在损伤作用下,AF可发生表型改变、增殖和迁移活性提高,释放细胞外基质(Extracellular matrix, ECM),促进新生外膜形成,导致血管外膜重构。血管外膜在高血压血管重构中的作用越来越受到重视,针对干预血管外膜重构的药物研究具有理论依据和应用价值。胶原是ECM的重要成分,Ⅰ型和Ⅲ胶原蛋白是血管壁的主要胶原蛋白类型。胶原的合成多于降解,胶原蛋白异常表达是高血压血管病变的重要病理变化。血管壁AF也是合成胶原蛋白的主要细胞类型,转化生长因子β1(Transforming growth factor β1, TGF-β1)是刺激AF合成和胶原蛋白沉积的强大始动因子,可在明显促进胶原蛋白基因转录的同时,抑制新合成胶原蛋白的降解。TGF-β1的经典下游信号通路是Smad信号通路。Smad3是受体调节型Smad(Receptor activated Smad, R-Smad)蛋白的重要成员,在TGF-β1细胞内信号转导通路中发挥着核心的作用。我们的前期体外研究,发现Smad3在TGF-β1诱导的AF转化和胶原沉积中起重要作用。芩丹胶囊(Qindan Capsule, QC)是导师的临床经验方,用于原发性高血压病肝热血瘀证的治疗。多年来,针对QC的疗效和药理作用机制进行了系列研究。以往的临床实验研究,发现QC能够在有效降压的同时,降低原发性高血压患者血浆中的TGF-β1水平,改善其肝热血瘀证的临床症状和血栓前状态；在体动物实验研究,发现QC能够有效降低自发性高血压大鼠(Spontaneous Hypertensive Rat, SHR)的血压和血浆中的血管紧张素Ⅱ(Angiotonin Ⅱ, AngⅡ)水平,抑制骨桥蛋白(Osteopondin, OPN)表达和血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cell, VSMC)转化,下调动脉中膜的胶原容积比例,提高动脉形态学指标,起到逆转SHR动脉中膜重构的作用；近期的体外细胞研究,发现QC在降低TGF-β1刺激引起AF的胶原蛋白高表达的同时,抑制了Smad3的活性。本研究在已往研究的基础上,通过对SHR动脉外膜病理变化的观察,及Ⅰ、Ⅲ型胶原和TGF-β1、Smad3在外膜表达的检测,进一步研究和探讨QC对高血压血管外膜重构的作用和机制,为其临床应用提供科学依据。目的1.观察芩丹胶囊对SHR大鼠血压和胸主动脉外膜形态学的改变。2.检测芩丹胶囊对SHR大鼠胸主动脉外膜中Ⅰ、Ⅲ型胶原和TGF-β1、 Smad3表达的改变。方法1.研究对象：(1)实验动物：24只(重250-290g)的14周龄雄性SHR大鼠和8只(重240-280g)的14周龄京都(Wistar-Kyoto, WKY)大鼠。(2)实验分组：24只SHR大鼠随机平均分为3组：阳性对照组、QC治疗组、氯沙坦治疗组；8只WKY大鼠设为阴性对照组。(3)实验给药：QC治疗组给予芩丹胶囊750mg/kg/d,氯沙坦治疗组给予氯沙坦30mg/kg/d,阳性对照组和阴性对照组分别给予等量生理盐水。所有大鼠均每日1次同时灌胃,连续12周。(4)实验取材：大鼠末次灌胃后禁食24h,10%水合氯醛腹腔注射,麻醉后取胸主动脉血管。2.研究内容：(1) tail-cuff plethysmographic (TCP)测压法测定大鼠收缩压(2)Van Gieson (V-G)染色法观察大鼠胸主动脉外膜的组织形态。(3)逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription PCR, RT-PCR)法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原和TGF-β1、Smad3的mRNA表达。(4)免疫组化法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原和TGF-β1、Smad3的蛋白表达。3.统计学处理：实验数据均用x±s表示,应用统计软件SPSS20.0进行分析,P＜0.05为差异有统计学意义。t检验用于两组间的比较,双因素方差分析用于多组间的比较。结果1.各实验组大鼠血压的比较在用药前,与阴性对照组中血压正常的WKY大鼠(14周龄)比较,阳性对照组、QC治疗组、氯沙坦治疗组中所有SHR大鼠(14周龄)血压已经明显升高(P＜0.01),阳性对照组和QC治疗组、氯沙坦治疗组相比差异无显著性(P均＞0.05)。在用药过程中,阳性对照组SHR大鼠血压呈升高趋势,QC治疗组、氯沙坦治疗组中所有SHR大鼠血压持续下降,阴性对照组中WKY大鼠血压稳定在正常范围。用药结束,与阴性对照组中血压正常的WKY大鼠(26周龄)相比,阳性对照组SHR大鼠(26周龄)血压显著降低(P＜0.01)。从给药第3周起,QC治疗组、氯沙坦治疗组大鼠和阳性对照组大鼠相比,血压均有下降(P＜0.05或P＜0.01)。给药5周后至给药结束,QC治疗组、氯沙坦治疗组大鼠和阳性对照组大鼠相比,血压有明显下降(P均＜0.01)。给药期间,QC治疗组、氯沙坦治疗组大鼠血压下降的比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。2.各实验组大鼠用药后胸主动脉外膜组织形态比较V-G染色显示,阴性对照组WKY大鼠血管壁外膜排列整齐,胶原组织分布均匀,着色浅淡；阳性对照组SHR大鼠管壁外膜明显增厚,僵硬变直甚至断裂剥脱,胶原面积明显增加,着色深染；与阳性对照组相比,QC治疗组、氯沙坦治疗组血管壁外膜明显变薄,排列较规整,胶原面积明显减少,着色变浅。QC治疗组和氯沙坦治疗组间的比较无明显差别。3.各实验组大鼠用药后胸主动脉外膜Ⅰ、Ⅲ型胶原和TGF-β1、Smad3的mRNA表达比较与阴性对照组26周龄血压正常的WKY大鼠相比,阳性对照组26周龄的SHR大鼠胸主动脉外膜组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原和TGF-β1、Smad3的mRNA表达显著升高(P＜0.01)；而同周龄QC治疗组、氯沙坦治疗组SHR大鼠外膜组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原和TGF-β1、Smad3的mRNA表达,较阳性对照组SHR大鼠均下降(P＜0.05或P＜0.01)；QC治疗组和氯沙坦治疗组间的比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。4.各实验组大鼠用药后胸主动脉外膜Ⅰ、Ⅲ型胶原和TGF-β1、Smad3的蛋白表达比较与阴性对照组26周龄血压正常的WKY大鼠相比,阳性对照组26周龄的SHR大鼠胸主动脉外膜组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原和TGF-β1、Smad3的蛋白表达显著升高(P＜0.01)；而QC治疗组、氯沙坦治疗组中同周龄SHR大鼠外膜组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原和TGF-β1、Smad3的蛋白表达,较阳性对照组SHR大鼠均下降(P＜0.05或P＜0.01)；QC治疗组和氯沙坦治疗组间的比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。结论1.芩丹胶囊对SHR大鼠有明显的的降压作用,降压机制与降低SHR大鼠血管外膜TGF-β1和Smad3的表达有关。2.芩丹胶囊能够降低SHR大鼠血管外膜中胶原的表达,改善外膜形态学,对血管外膜重构有抑制或逆转作用,机制与抑制TGF-β1/Smad3信号转导通路有关。研究背景血管重构(Vascular remodeling, VR)是心血管疾病发病的病理基础,也是高血压靶器官损害的病理基础,发掘和研究能对抗和逆转VR的抗高血压药物具有重大意义。血管外膜对血压的改变最为敏感,成纤维细胞是血管外膜中的主要细胞成分,其生物学活性异常可导致血管损伤后不良重构和血管再狭窄的发生。高血压可促使血管外膜成纤维细胞(Adventitial fibroblast, AF)变为肌成纤维细胞(Myofibroblast, MF), MF迁移至中膜或内膜,同时可促进细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)合成,发生纤维化,缩窄血管管腔,导致VR发生转化生长因子β1(Transforming growth factor β1, TGF-β1)与VR的发生和发展关系最为密切,是刺激AF发生表型转换、增殖和迁移、合成ECM最重要和最直接的信号因子。Smad信号通路也是近年发现的,与众多组织纤维化密切相关的TGF-β1下游信号通路。我们以前的研究已证实Smad2和Smad3介导了AF对TGF-β1的反应。而TGF-β1的生物学功能也受丝裂素活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)的调控,该作用能被特异性MAPK抑制剂阻断。MAPK信号途径(主要包括ERK、JNK及p38)是细胞内最重要的网络信号之一,参与介导细胞增殖、迁移、分化等多种病理生理过程,与纤维化性疾病的发生密切相关。由受体酪氨酸激酶激活的MAPK通过磷酸化Smads作用可以改变TGF-β1信号。研究具体信号通路TGF-β1/ERK在高血压血管重构中的作用和机制具有重要意义。血管重构的过程是一个伴随着ECM大量合成与降解的过程。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase, MMP)是机体内降解ECM的主要酶系,MMP2和MMP9是其主要成分,基质金属蛋白酶合成(Matrix metalloproteinase synthesis,MMPs)在高血压的血管重构过程中发挥了重要作用。结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor, CTGF)是一种可刺激成纤维细胞增殖和分泌胶原蛋白的生长因子,能够促进细胞有丝分裂、参与凋亡调节及血管形成,与动脉粥样硬化和器官纤维化疾病的发生密切相关。CTGF基因属即刻早期基因,启动子中含有TGF-β1的应答元件,能够被TGF-β1选择性地诱导后激活,并且作为其下游介质,促进ECM的合成。目前,CTGF与血管功能和不良重构的研究成为研究心血管病防治的重要靶点。高血压病属于中医学“眩晕”范畴,肝热血瘀证是临床常见证型。芩丹胶囊(Qindan capsule, QC)是导师应用多年治疗肝热血瘀型高血压病的临床经验方,以往的研究表明,QC通过影响TGF-β1/Smad信号通路,抑制AF增殖和胶原合成,在逆转老年自发性高血压大鼠(Spontaneous hypertensive rat, SHR)血管外膜重构中发挥重要作用,但是其对AF的生物活性、MMP2和MMP9、CTGF的合成及TGF-β1/ERK信号通路的影响尚不明了。本研究在已往研究的基础上继续探讨QC对TGF-β1诱导的AF增殖和迁移活性、周期和凋亡调控及MMPs和CTGF合成的影响,以及在此过程中TGF-β1/ERK信号转导通路的作用,以期为该临床验方的应用和开发提供更多科学依据。目的1.观察QC含药血清对TGF-β1诱导的AF增殖、迁移、周期和凋亡调控的变化,证实QC对TGF-β1诱导的AF生物活性的影响。2.观察QC含药血清对TGF-β1诱导的AF中细胞外信号调节激酶1/2(Extracellular signal-regulated kinase1/2, ERK1/2)、磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2(phospho-ERK1/2, p-ERK1/2)、MMP2、MMP9和CTGF表达的变化,证实QC对AF中基质金属蛋白酶和结缔组织生长因子合成的影响,探讨TGF-β1/ERK信号转导通路在血管外膜重构中的作用。方法1.制备芩丹胶囊含药血清：90只(重240-280g)14周龄雄性京都(Wistar-Kyoto, WKY)大鼠随机分成3组：芩丹胶囊大剂量组(QCH组)给予芩丹胶囊750mg/kg/d,芩丹胶囊小剂量组(QCL组)给予芩丹胶囊150mg/kg/d,氯沙坦组(Losartan组)给予氯沙坦30mg/kg/d。各实验组大鼠均予以灌胃给药,每日2次,连续4天。大鼠末次给药后禁食24h,麻醉1.5h后,经腹主动脉取血,分离血清,同一组混匀,滤菌,56℃灭活30min,在低温真空干燥机中制成血清冰冻干粉,-20℃保存备用。2.外膜成纤维细胞获取和干预：(1)剥脱WKY大鼠胸主动脉血管外膜,组织贴块法原代培养纤维母细胞,冻存、复苏、传代培养成纤维细胞。(2)含药血清预刺激：传代培养的外膜成纤维细胞换无血清培养基培养4h后,在无血清培养基中加入等容的血清冻干粉培养48h。阴性对照组不加任何处理因素。(3)TGF-β1诱导：用含有TGF-β1(20ng/ml)的普通培养液培养24h。3.实验分组：分为5组：(1)阴性对照(negative control, NC)组(2)阳性对照(positive control, PC)组(3)芩丹胶囊大剂量(QCH)组(4)芩丹胶囊小剂量(QCL)组(5)氯沙坦(Losartan)组4.研究内容：(1)MTT比色法(MTT colorimetry assay)检测细胞增殖率。(2)划痕技术(Transwell assay)测定细胞迁移能力。(3)流式细胞学检测和分析细胞周期和凋亡调控。(4)反转录酶聚合酶链锁反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)检测CTGF.MMP2和MMP9的mRNA表达。(5)蛋白质印迹(Western blot)检测ERK1/2、p-ERK1/2、CTGF、MMP2和MMP9的蛋白表达。5.统计学处理：实验数据均用x±s表示,应用统计软件SPSS20.0进行分析,t检验用于两组间的比较,方差分析用于多组间的比较,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.各实验组AF增殖活性比较与NC组相比,PC组AF增殖活性明显增强(P＜0.01)；经药物处理后,QCH组、QCL组和Losartan组增殖活性均有减弱,与PC组相比,有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01)；QCH组和Losartan组间的比较,无统计学意义(P>0.05)。2.各实验组AF迁移数量比较与NC组相比,PC组AF迁移数量明显增多(P＜0.01)；经药物处理后,QCH组、QCL组和Losartan组迁移数量均有减少,与PC组相比,均有统计学差异(P＜0.05)；QCH组和Losartan组间的比较,无统计学意义P＞0.05)。3.各实验组AF细胞周期比较与NC组相比,PC组AF的G0/G1和G2/M的细胞百分比明显增大(P＜0.01和P＜0.05)；经药物处理后,QCH组、QCL组和Losartan组AF的G0/G1和G2/M细胞百分比均有减少,与PC组相比,均有统计学差异(P＜0.05)；QCH组和Losartan组间的比较,无统计学意义(P＞0.05)。4.各实验组AF细胞凋亡比较与NC组相比,PC组AF的早期凋亡细胞百分比明显减少(P＜0.01)；经药物处理后,QCH组、QCL组和Losartan组早期凋亡细胞百分比均有增大,与PC组相比,均有统计学差异(P＜0.01或P＜0.05)；QCH组和Losartan组间的比较,无统计学意义(P＞0.05)。5.各实验组AF中CTGF、MMP2和MMP9的mRNA表达比较与NC组相比,PC组AF的CTGF、MMP2和MMP9的mRNA表达明显增强(P＜0.01)；经药物处理后,QCH组、QCL组和Losartan组CTGF、MMP2和MMP9的mRNA表达明显减弱,与PC组相比,均有统计学差异(P＜0.05)；QCH组和Losartan组间的比较,无统计学意义(P＞0.05)。6.各实验组AF中ERK1/2、p-ERK1/2、CTGF、MMP2和MMP9的蛋白表达比较与NC组相比,PC组的p-ERK1/2、CTGF、MMP2和MMP9的蛋白表达明显增强(P＜0.01)；经药物处理后,QCH组、QCL组和Losartan组AF的p-ERK1/2、CTGF、MMP2和MMP9的蛋白表达明显减弱,与PC组相比,均有统计学差异(P＜0.05)；QCH组和Losartan组间的比较,无统计学意义(P＞0.05)。ERK1/2蛋白的表达在所有实验组间的比较,无统计学意义(P＞0.05)。结论1.芩丹胶囊能够通过影响TGF-β1诱导的AF的生物活性、基质金属蛋白酶和结缔组织生长因子合成,具有抑制或逆转血管外膜重构的作用。2.芩丹胶囊能够抑制TGF-β1/ERK信号转导通路,可能与抑制或逆转血管外膜重构的机制有关。