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神经介素B(NeuromedinB,NMB)是1983年从猪脊髓中分离纯化的一种神经肽,而胃泌素释放肽(Gastrin-releasing peptide,GRP)是1979年从猪胃组织中分离提纯的一种神经肽,均为哺乳动物蛙皮素(Bombesin,BN)样肽,分别通过NMBR和GRPR发挥生理功能。在体内,NMB与NMBR高亲和力,与GRPR的亲和力较低;而GRP与GRPR高亲和力,与NMBR的亲和力较低。NMB/GRP与其受体NMBR/GRPR广泛分布于中枢神经系统和外周组织,参与调节多种生物学作用,包括:刺激平滑肌收缩、介导应激和恐惧反应、参与摄食和体温调节、促进正常和肿瘤细胞增长等。目前,NMB/GRP及其受体的研究主要集中在人和大小鼠上,关于NMB/GRP及其受体在猪体内的研究还鲜有报道。因此,本研究以小梅山猪为研究对象:克隆了 NMB/GRP及其受体基因,研究了 NMB/GRP及其受体mRNA在猪体内的表达情况、及NMBR/GRPR在猪外周组织的分布定位,并检测了 NMB及其受体mRNA在小梅山公猪生殖轴的生后发育性变化。另外,通过体外培养的猪睾丸间质细胞,研究了NMB/GRP对猪睾丸间质细胞睾酮分泌的影响和影响睾酮分泌的作用机制,并研究了NMB/GRP对猪睾丸间质细胞增殖和凋亡的影响。通过以上研究旨在发现NMB/GRP对猪可能的生理作用及阐明NMB/GRP对公猪生殖调控的作用机制。一、猪NMB及其受体基因克隆本试验通过基因克隆技术,克隆了猪NMB和NMBR基因,并采用生物信息学技术对猪NMB及其受体核苷酸和氨基酸序列进行了分析。结果如下:1.克隆了 567bp猪NMBcDNA,开放阅读框为366bp,编码121个氨基酸,信号肽为24个氦基酸,成熟肽为32个氦基酸,保守序列为NMB-10(GNLWATGHFM)。2.克隆的猪NMBR基因为1,173bp,开放阅读框为1,173bp,编码390个氨基酸,为G-蛋白偶联受体,具有七次跨膜结构,定位在猪的第1号染色体上,基因序列已提交到 NCBI 的 GenBank(GenBank ID:KM058699)。3.猪NMB及其受体核苷酸和氨基酸序列与其他物种之间具有高度的同源性和保守性,遗传进化上比较接近。二、NMB及其受体在猪体内的表达和NMBR在猪外周组织的分布定位本试验通过荧光定量PCR研究了 NMB及其受体mRNA在猪体内的表达情况,并采用免疫组织化学技术研究了 NMBR在猪外周组织器官中的分布定位。结果如下:1.NMBmRNA主要在中枢神经系统表达,在嗅球的表达水平最高,在脑中其它部位也有较高水平表达;在外周,主要表达于胰、肾上腺、睾丸和卵巢等组织器官。2.NMBRmRNA主要在外周组织表达,在胰的表达水平最高,在淋巴组织、腺体和生殖器官中也有较高水平表达;在中枢神经系统,主要表达于小脑和垂体。3.NMBR-ir广泛分布于猪外周组织器官中,包括:呼吸、循环、消化和泌尿生殖系统、淋巴器官和内分泌腺。以上结果表明,NMB在猪体内可能具有多种重要的生理功能。三、猪GRP及其受体基因克隆本试验通过电子克隆技术和/或基因克隆技术,克隆了猪GRP和GRPR基因,并利用生物信息学技术对猪GRP及其受体核苷酸和氨基酸序列进行了分析。结果如下:1.获得了猪GRP基因的电子克隆序列;克隆了 608 bp的猪GRP基因,开放阅读框为441 bp,编码146个氨基酸,信号肽为23个氦基酸,成熟肽为27个氨基酸,保守序列为GRP-10;猪GRP核苷酸和氦基酸与其他物种有较高的同源性和保守性,猪GRP与牛、羊和马等物种亲缘关系较近。2.克隆的猪GRPR基因为1,487bp,开放阅读框为1,155bp,编码384个氨基酸,为G-蛋白偶联受体,具有七次跨膜结构,定位在猪的第X号染色体上,基因序列已提交到NCBI的GenBank(GenBankID:KM052179.1);猪GRPR核苷酸和氦基酸序列与其他物种之间具有高度的同源性和保守性,猪GRPR在遗传进化上与牛、羊和马最为接近。四、GRP及其受体在猪体内的表达和GRPR在猪外周组织的分布定位本试验通过荧光定量PCR研究了 GRP及其受体mRNA在猪体内的表达情况,并利用免疫组织化学技术研究了 GRPR在猪外周组织器官中的分布定位。结果如下:1.GRPmRNA主要在外周组织中表达,在食管的表达水平最高;在胃肠道、消化腺,泌尿生殖系统、淋巴器官和肺中都有较高水平的表达。2.GRPR mRNA在中枢神经系统和外周组织广泛表达,在胰的表达水平最高,在消化器官、生殖器官、淋巴器官、骨骼肌和脂肪中也有较高水平的表达;在中枢神经系统,主要在小脑、垂体、脊髓和下丘脑表达。3.GRPR-ir在猪外周器官中的分布比较广泛,主要分布于心、肺、消化系统、泌尿生殖系统、内分泌组织和淋巴器官中。以上结果表明,GRP可能对猪的生理功能具有重要的调节作用。五、NMB及其受体在不同日龄小梅山公猪性腺轴中的表达本试验采用荧光定量PCR研究了 NMB及其受体mRNA在小梅山公猪下丘脑-垂体-睾丸(HPT)轴的生后(3～120d)发育性变化。结果如下:1.在下丘脑,NMB mRNA在60 d表达最高,随后表达水平逐渐降低至生后3d时的水平;而NMBRmRNA在生后30 d表达量即达到最高,随后表达量逐渐减小,到90d时基本降到生后3d时的水平,到120d时表达量明显降低,达到最低。2.在垂体,NMB mRNA在幼年(30 d)和初情前期(60 d)表达水平较高,在初情期(90d)和早期性成熟阶段(120d)表达量反而较低;NMBRmRNA在出生后到幼年这个时期表达量变化不明显,到了初情前期表达水平明显升高,随后一直持续较高表达。3.在睾丸,NMB mRNA在生后3d和幼年期表达量较高,到初情前期表达量明显降低,达到最低水平,然后随着小梅山公猪的发育NMB mRNA的表达量逐渐增加,但低于幼年阶段时的表达水平;NMBRmRNA在初生(3d)和初情期高表达,在其它几个阶段的表达量明显降低。以上结果表明,NMB可能对公猪的生殖功能具有重要的调节作用。六、NMB对体外培养的猪睾丸间质细胞的作用及机制为了探讨NMB对公猪生殖功能的影响,本试验研究了 NMB对体外培养的猪睾丸间质细胞睾酮分泌的影响及影响睾酮分泌的作用机制,并研究了 NMB对睾丸间质细胞增殖与洞亡的影响。结果如下:1.一定剂量的NMB可以促进睾丸间质细胞睾酮的分泌,NMBR拮抗剂BIM23127能够阻断NMB促睾酮分泌的作用。2.NMB能够促进睾丸间质细胞睾酮合成关键酶STAR、CYP11A1、CYP17A1、3β-HSD和HSD17B1 mRNA和蛋白的表达,NMBR拮抗剂可以阻断NMB促进睾酮合成关键酶的表达。3.NMB可以促进睾丸间质细胞增殖,并能够促进增殖相关蛋白PCNA和Cyclin B1的表达。4.NMB可能通过减少凋亡相关蛋白Caspase-3和Bax的表达,抑制睾丸间质细胞凋亡。以上结果表明,NMB/NMBR系统可以通过调节睾丸间质细胞睾酮合成关键酶的表达促进睾酮的合成和分泌,并能够通过增加增殖相关蛋白和减少凋亡相关蛋白的表达参与调节睾丸间质细胞的增殖与凋亡,为研究NMB对公猪生殖作用机制提供了试验依据。七、GRP对体外培养的猪睾丸间质细胞的作用及机制本试验研究了不同剂量的GRP对体外培养的猪睾丸间质细胞的作用及机制,结果表明:GRP可能通过GRP/GRPR系统调节猪睾丸间质细胞睾酮合成关键酶STAR、CYP11A1、CYP17A1、3β-HSD和HSD17B1的表达来促进睾酮的合成与分泌,并能通过调节增殖相关蛋白(PCNA和CyclinB1)和凋亡相关蛋白(Caspase-3和Bax)的表达促进睾丸间质细胞的增殖,为研究GRP对公猪生殖功能奠定了理论基础。