唾液腺癌是口腔临床中较多见的恶性肿瘤,由于唾液腺癌发病机制较为复杂,发生发展机制尚不清楚,因此临床口腔恶性肿瘤的早期诊断和防治较为困难,并且有些口腔癌复发率较高,预后差,因此认识口腔恶性肿瘤的发生发展机制,对于提前预防和发病后的治疗具有重要的意义。垂体瘤转化基因(Pituitary tumor transforming gene,PTTG)作为人类securin蛋白,具有参与细胞有丝分裂、抑制染色体配对、影响染色体复制稳定性的特性,但尚缺乏对该基因过表达与肿瘤转移的相关性研究,对该基因在唾液腺癌中的过表达及与唾液腺癌发生发展相关性缺乏全面的研究。近年来,碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对于诱导肿瘤、促进肿瘤迅速生长和转移的研究较为热门,bFGF的过表达和癌症是否有转移及癌症治疗的预后均具有密切的关系。因此,本文通过通过免疫组化、免疫印迹分析法(Western blot analysis)、实时半定量逆转录聚合酶链反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)法等研究PTTG在人类下颌下腺粘液表皮样癌中的表达,探讨PTTG在唾液腺恶性肿瘤中的致癌作用；并通过来源于下颌下腺粘液表皮样癌细胞A-253细胞系中构建PTTG过表达和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR) marker共表达,研究PTTG对A-253细胞增殖和迁移的作用,PTTG能否作为唾液腺恶性肿瘤诊断的合适标记和抗癌治疗的潜在靶标,为临床下颌下腺粘液表皮样癌的发生发展及诊治提供基础研究依据。通过免疫组化和RT-qPCR的方法对bFGF在下颌下腺恶性肿瘤中过表达的研究,探讨bFGF在下颌下腺恶性肿瘤的发生、发展中的作用,分析bFGF与患者的生存时间、术后效果和预后的关系,为临床下颌下腺恶性肿瘤的治疗和预后评估提供参考。第一部分PTTG过表达促进下颌下腺粘液表皮样癌迁移的研究目的：通过免疫组化、免疫蛋白印记分析法、RT-qPCR.细胞计数和细胞迁移等方法研究PTTG在人类下颌下腺恶性肿瘤粘液表皮样癌中的表达,探讨PTTG在唾液腺恶性瘤中的致癌作用；并通过在来源于人类粘液表皮样癌A-253细胞中构建PTTG过表达与EGFR marker共表达,研究PTTG对A-253细胞增殖和迁移的作用,PTTG能否作为唾液腺恶性肿瘤诊断的合适标记和抗癌治疗的潜在靶标。为临床对人类唾液腺恶性肿瘤的发生发展及诊治提供基础性研究依据。方法：随机选取经病理诊断为下颌下腺粘液表皮样癌癌组织19例为实验组(全部是在患者进行化疗和放疗前术中切除),并平行随机选取18例正常下颌下腺组织为对照组,所有标本均详细记录年龄、肿瘤大小、是否有淋巴结转移、组织学分型。实验研究经伦理委员会同意批准,并征得全部受试者同意。同时在体外构建A-253 PTTG(+)和A-253 PTTG(-)细胞系。1.免疫组织化学染色观察分析下颌下腺粘液表皮样癌组织中及正常腺体切片组织中PTTG的表达；2.分离下颌下腺粘液表皮样癌及A-253细胞系中RNA,并采用RT-qPCR法对PTTG在mRNA水平上的表达进行定量；3.肿瘤样本的PTTG蛋白水平表达通过蛋白印迹分析试验进行分析,肿瘤样本在蛋白分离前进行了均一化处理、收集和溶解,添加蛋白酶抑制剂混合物,用12%的聚丙烯酰胺凝胶进行分离,再转到硝酸纤维素膜上,通过连续用抗PTTG或抗β肌动蛋白多克隆家兔抗体,一种过氧化物酶结合的二级抗体和电化学发光检测系统对PTTG和β肌动蛋白进行定量；4.细胞计数与细胞迁移分析：细胞计数分析利用血球板计数,活细胞用锥虫蓝染色后用血球计数器计数数目,细胞迁移通过划痕实验进行检测,待90%接种的A-253PTTG(+)或A-253 PTTG(-)细胞在六孔板上融合后,用细胞刮片刮涂融合细胞,用PBS洗涤2次,取出划下的细胞,加入无血清培养基,放入37℃5%C02培养箱,每3小时测量一次细胞运动的距离,48小时后,观察并计数穿过基准线的迁移细胞,所有实验均重复三次。所有数据均采用X±S表示,两组间PTTG表达的阳性率通过X2检验进行比较,两组间PTTG在mRNA水平、蛋白水平以及细胞计数分析采用t检验,p<0.05认为有统计学意义。结果：1.唾液腺恶性肿瘤样本中PTTG的过表达：①下颌下腺粘液表皮样癌组织中阳性PTTG细胞的比例高于下颌下腺组织(14/19 vs 7/18,p=0.0327)；②为进一步揭示肿瘤与非肿瘤之间PTTG水平的差异,本研究分析了两组中所有样本的PTTG在mRNA水平的表达量,下颌下腺粘液表皮样癌样本中PTTG mRNA是1.772±0.187(n=19),对照组中的平均水平1.032±0.096(n=18),两组间比较具有显著性差异(p=0.0014)；③利用免疫蛋白印迹法分析下颌下腺粘液表皮样癌样本中的PTTG蛋白水平显著高于对照样本(p<0.05)。2.A-253 PTTG(+)细胞系稳定表达PTTG:①通过RT-qPCR检测,PTTG mRNA水平在A-253 PTTG(+)细胞中表达均明显高于对照组A-253 PTTG(-)细胞(p<0.01)；②PTTG蛋白水平在A-253PTTG(+)细胞中表达明显高于A-253 PTTG(-)细胞(p<0.01)。3.PTTG的过表达促进A-253细胞的生长和迁移：①细胞计数分析进行评估,在体外接种12、24、48小时后A-253 PTTG(+)细胞的接种量为4.51±0.38×104/mL, A-253 PTTG(-)细胞接种量为3.733±0.32×104/mL,二者有显著性差异(p<0.05)；②用10’3/mL的接种量再次验证生长差异,A-253 PTTG(+)细胞的有效生长同样显著高于A-253 PTTG(-)细胞。③划痕分析迁移通过基准线的A-253 PTTG(+)细胞多于A-253 PTTG(-)细胞(92.67±7.51 vs.41±4.62,p<0.01)。结论：1.PTTG在人类下颌下腺粘液表皮样癌中过表达；2.PTTG能够促进下颌下腺粘液表皮样癌细胞的增殖和迁移；3.PTTG可以作为唾液腺恶性肿瘤诊断的合适标记和抗癌治疗的潜在靶标。第二部分bFGF在下颌下腺恶性肿瘤中的表达及对其预后影响的研究目的：通过研究bFGF在下颌下腺恶性肿瘤组织中的表达,探讨bFGF在下颌下腺恶性肿瘤发生、发展中的作用,分析bFGF与患者的生存时间、术后效果和预后的关系,为临床下颌下腺恶性肿瘤的治疗和预后评估提供参考。方法：随机选取行下颌下腺恶性肿瘤切除经病理学确诊的癌组织标本32例,全部患者均在术前签署知情协议书,全部实验过程均经伦理委员会通过。其中男性患者为19例,女性为13例,平均年龄为45.6±4.8岁；其中Ⅰ期为8例,Ⅱ期为12例,Ⅲ期为10例,Ⅳ期为2例；患者的生存期平均为39.2±4.5个月。1.免疫组化法检测下颌下腺癌组织和正常腺体组织中bFGF的表达,按照着色深度及百分率进行结果判定,积分为0用(-)表示,1到3分为弱阳性用(+)表示,4-8分用(++)表示,9-12分用(+++)表示,记录结果后进行复核,(++)为阳性表达；2.RT-PCR法检测下颌下腺癌bFGF mRNA的表达,并以β-action作为内参；3.所得统计学数据根据临床分期、组织病理学类型、年龄结构、性别、预后等进行分组比较。结果：1.下颌下腺恶性肿瘤中bFGF表达情况：①免疫组化结果中bFGF在细胞质和细胞膜中阳性表达呈棕黄色颗粒,在阴性对照组中无表达,在32例患者中,bFGF无表达8例(25%),弱表达6例(18.75%),中度表达16例(50%),强阳性表达2例(6.25%),其中(++)为阳性表达,本研究阳性表达率为56.25%(18/32),阴性表达率为43.75%(14/32)；②进一步采用RT-PCR验证下颌下腺癌组织的bFGF的表达0.82±0.21均高于正常下颌下腺组0.11±0.08,差异具有统计学意义(P=0.010)。2.bFGF表达情况与临床特征的关系：①bFG F阳性表达率与患者性别、年龄无关(p>0.05)；②腺样囊性癌中bFGF表达阳性者为8例(61.53%),粘液表皮样癌阳性者为7例(53.84%),其他腺癌中阳性者为3例(50.00%),不同病理类型阳性表达差异无统计学意义(P>0.05)；③不同临床分期患者的bFGF阳性表达情况比较,Ⅰ期8例,bFGF阳性表达3例(37.50%),Ⅱ期12例,bFGF阳性表达6例(50.00%),10例Ⅲ期中bFG F阳性表达6例(60.00%),2例Ⅳ期中bFGF阳性表达者2例(100.00%),结果发现不同临床分期患者间,bFGF阳性表达差异有统计学意义(P<0.01)。3.bFGF表达与下颌下腺恶性肿瘤患者术后生存情况的关系：①患者的生存期平均为39.2±4.5个月,其中bFGF阳性表达者平均生存期27.8±2.6个月,bFGF阴性表达者平均生存期为54.3±4.7个月,阴性表达患者的生存期显著大于阳性表达患者(P=0.001)；②bFGF阳性表达者,男性生存时间要长于女性(P=0.012),阴性表达者中,男性与女性之间生存时间无明显统计学差异(P>0.05)；③按<60岁和≥60岁分组,2组生存时间无差异(P>0.05),而两组中bFGF阴性表达预后均优于阳性表达(P<0.05)；④对于不同病理类型的下颌下腺恶性肿瘤,bFGF表达阴性者生存预后均优于bFGF阳性表达者(P<0.05)；⑤bFGF阳性表达组,TNM临床分期较早的患者生存时间较长(P<0.05)。结论：1.bFGF在下颌下腺恶性肿瘤中高表达,其表达水平与年龄、性别、组织病理分型无关,而与临床分期、生存时间相关。2.在下颌下腺恶性肿瘤组织中,bFGF表达阳性的患者其生存期明显低于阴性表达者,可以作为判断下颌下腺恶性肿瘤的一项独立因素；在bFGF阳性表达时,男性和TNM临床分期较早的患者生存时间较长。