论文部分内容阅读
研究目的:低氧训练是一种提高运动成绩的有效训练手段,在低氧环境下训练,使机体能够产生一系列低氧环境下的运动适应,从而有效增强机体的有氧代谢能力,但作用机制还不明确。本项目采用氧浓度为14.2%的低压氧舱（相当于海拔高度3000 m）建立小鼠低氧训练实验模型,以期探讨低氧训练诱导的细胞自噬提高有氧运动能力及其相应的分子机制或信号通路。研究方法:雄性KM小鼠90只（8周龄,体重:39.56±3.36 g）随机分为六组,包括常氧对照组（NC组）、低氧对照组（HC组）、常氧训练组（NE组）、低氧训练组（HE组）、低氧+氯喹组（Chloroquine,CQ,HQ组）、低氧+氯喹+训练组（HEQ组）,每组15只小鼠。适应新环境1周后,将60只低氧组小鼠置于低氧仓（14.2%O2）,NC组和NE组小鼠置于常氧室。CQ组小鼠每日腹腔注射CQ一次,按照40 mg/kg/d剂量连续注射8周。小鼠有氧运动训练方案:NE、HE和HQE组小鼠接受为期8周的游泳训练,每周5次,在常氧条件下训练60分钟。力竭运动方案和运动能力评估:力竭运动亚组小鼠（共30只,每组5只）进行强制力竭游泳,记录力竭时间评估运动能力。低氧训练干预实验结束后,测试BLA、Hb、SOD、MDA结合力竭游泳时间评估有氧运动能力。采用组织学和免疫荧光等实验方法评估小鼠心肌和腓肠肌细胞自噬与凋亡情况;通过透射电镜观察心肌和腓肠肌细胞内线粒体与自噬溶酶体的结构变化;免疫印迹分析自噬、凋亡、氧化应激、线粒体质量控制、能量代谢相关蛋白的表达。Western blot测定指标包括Nrf2、Keap1;Parkin、Mnf2、Drp1;AMPK、phosphor-AMPK、PGC-1α、Irisin;Beclin1、LC3-I、LC3-II、p62;Bcl-2、Bax;GAPDH;同时计算LC3-II/LC3-I相对比例。研究结果:（1）低氧训练提高有氧运动能力:与NC组相比,HC、NE、HE组小鼠的力竭游泳运动时间呈现明显的延长、而HQ组小鼠力竭游泳时间显著缩短;生化指标的变化:NE、HE组小鼠Hb浓度显著增加、SOD活力值显著提升、而MDA浓度显著减少,以HE组效果最为显著（p<0.05）;HQ组小鼠Hb浓度减少、SOD活力值下降、而MDA浓度显著上升（p<0.05）;力竭运动后BLA恢复情况:与NC组相比,力竭运动后BLA的变化趋势显示HE组小鼠在运动后下降最为迅速,下降最为缓慢的是HQ组小鼠。（2）透射电镜下观察到正常组小鼠心肌和腓肠肌纤维中线粒体排列紧密、分布均匀,呈圆形或椭圆形,线粒体膜、线粒体嵴清晰可见,未见断裂,基质均匀。而HC组心肌和腓肠肌组织略显稀疏,肌纤维结构排列尚整齐,可见散在自噬小体,Western blot检测发现HC组小鼠心肌和腓肠肌Drp1和Parkin表达显著增加。NE组心肌和腓肠肌结构稍见紊乱,线粒体嵴清晰可见,未见断裂,基质均匀,可见自噬小体;HE小鼠心肌和腓肠肌结构排列整齐,肌纤维间可见大量线粒体,结构清晰,可见线粒体嵴,可见自噬小体;Western blot检测发现NE和HE组小鼠心肌和腓肠肌Mfn2、Drp1和Parkin表达显著增加,但是HE组小鼠Mfn2上升幅度最大、Drp1和Parkin增加幅度最小（p<0.05）;而HQ组小鼠心肌和腓肠肌组织结构紊乱,心肌纤维出现断裂,可见线粒体大小、形态改变,出现肿胀、嵴断裂、基质密度减低,线粒体空泡化明显,可见自噬小体;HQ组小鼠心肌和腓肠肌Mfn2表达下降、Drp1和Parkin表达上升（p<0.05）。说明低氧训练促进心肌和腓肠肌组织线粒体融合而抑制线粒体分裂,心肌和腓肠肌线粒体发生自噬而且改善线粒体质量显著强于常氧训练组。（3）通过Western blot检测发现,与NC组相比,HC、NE、HE、HQ、HQE组小鼠心肌和腓肠肌组织中Atg7、Beclin1、LC3-II/LC3-I的表达显著升高,而HE组小鼠心肌和腓肠肌组织中p62/SQSTM的表达较正常组显著下降,但是HQ、HQE组p62/SQSTM1的表达显著上升。免疫荧光的结果与Western blot结果吻合。说明常氧训练和低氧训练均可导致心肌和腓肠肌组织中自噬流（LC3-II/LC3-I增加,p62减少）上升;而氯喹阻断了细胞自噬,HQ、HQE组小鼠自噬流受阻。（4）通过Western blot检测发现,与NC组相比,NE、HE组小鼠心肌和腓肠肌中Bcl-2表达上升,HE组上升幅度大（p<0.05）;而HQ小鼠心肌和腓肠肌Bcl-2表达显著下降,并且Bax上升幅度最大（p<0.05）。TUNEL结果基本与Western blot结果吻合。说明低氧训练抑制小鼠心肌和腓肠肌细胞凋亡,而氯喹的应用促进小鼠心肌和腓肠肌细胞凋亡。（5）通过Western blot检测发现,与NC组相比,NE,HE组心肌和腓肠肌p-AMPK/AMPK、PGC-1α、Irisin表达显著上升（p<0.05）,HE组上升幅度最大;而HQ组小鼠心肌和腓肠肌p-AMPK/AMPK、PGC-1α以及腓肠肌Irisin表达显著下调（p<0.05）。说明常氧训练、低氧训练均可显著上调小鼠心肌和腓肠肌AMPK的磷酸化,上调PGC-1α及Irisin的表达,且低氧训练的效果要优于常氧训练,而氯喹的应用下调AMPK的磷酸化水平及PGC-1α表达。（6）通过Western blot检测发现,与NC组相比,各组心肌和腓肠肌中Nrf2表达显著上升,HE组上升幅度最大（p<0.05）;HC,NE,HE组心肌和腓肠肌Keap1表达显著下降;而HQ和HQE组心肌和腓肠肌Keap1表达显著上升（p<0.05）。常氧训练与低氧训练均可以激活小鼠心肌和腓肠肌Nrf2的表达,低氧训练的效果优于常氧训练。研究结论:14.2%氧浓度的低氧暴露联合无负重游泳训练可以提高有氧运动能力,其机制可能是由于低氧训练增加了能量代谢、提高了抗氧化应激能力、改善了线粒体质量以及抑制了细胞凋亡。低氧训练可能通过激活AMPK/PGC-1α/Nrf2信号通路诱导了细胞自噬激活。