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基因治疗是通过一定的方法、方式,将外源基因导入目的细胞并使其有效表达,以纠正基因的缺陷或在细胞中发挥作用,从而发挥治疗疾病的作用。基因治疗的关键就是选择合适的载体将目的基因准确的运送到靶细胞,并控制使其有效表达,发挥治疗作用。病毒型载体具有较高的转染效率,但病毒载体存在较严重的安全性问题。非病毒载体主要有阳离子聚合物、阳离子多肽和阳离子脂质体等,具有靶向性,低细胞毒性,较高的安全性,并且易于进行结构修饰等优点,已成为基因治疗中的热点,逐渐受到了越来越多的关注,对其研究已逐渐深入。PAMAM具有内部空腔结构,其末端基团精确可控,氨基易质子化而带正电,容易与DNA结合形成纳米级复合物,可以保护DNA并达到转染的目的,作为药物载体和基因载体具有较高的稳定性、生物兼容性良好、无免疫源性、使用剂量下低细胞毒性的优势。对PAMAM树状大分子末端基团进行表面修饰,减少表面的正电荷数目,以降低其细胞毒性,改善基因转染效率。透明质酸(Hyaluronic,简称HA)作为天然水溶性高分子,具有多种适宜作为作为药物载体的优良特性,包括生物兼容性良好、非免疫原性、高生物活性及易被体内酶作用而天然降解、靶向性。本研究以HA具有较好的肿瘤靶向性、增强复合物水溶性、生物兼容性,PAMAM具有较好的携带目的基因导入细胞中的理论基础为切入点,拟构建HA-PAMAM/p EGFP基因传递表达系统,深入研究其物理化学性能、生物性能、靶向性等方面的影响;从PAMAM分子量,HA接枝率和接枝密度,聚阳离子/基因重量比(w/w)等方面优化该传递系统,提高基因转染效率、降低细胞毒性、提高载体靶向性、稳定性等。本研究的主要内容:(1)PAMAM-HA聚合物的化学合成和结构表征:采用透明质酸(HA)与PAMAM在含有Na Cl的四氢硼酸钠(Na BH4)缓冲液中(p H8.5),在氰硼氢化纳(Na BH3CN)催化下反应生成PAMA-HA聚合物。不同PAMAM分子量、HA接枝量和接枝密度的PAMAM-HA样品同步制备并作比较。PAMAM-HA样品的化学结构有红外(IR)等鉴定。(2)对PAMAM-HA作为基因载体的性能考察:采用动态光散射发测定了PAMAM-HA/DNA复合物的粒径分布及表面电位;采用透射电镜(TEM)观察复合物粒子形态;通过琼脂糖凝胶阻滞实验考察PAMAM-HA结合并压缩DNA的能力。(3)PAMAM-HA细胞毒性:用MTT法考察PAMAM-HA各样品对不同肿瘤细胞的细胞毒性,并考察在PAMAM-HA/DNA的转染比例下的毒性。(4)PAMAM-HA体外转染研究:用Bel-7402细胞对PAMAM-HA/DNA复合物的最佳转染效率进行筛选并考察PAMAM-HA/DNA复合物在不同细胞之间的转染与PEI25K相比较,同时考察血清对转染效率的影响。(5)PAMAM-HA诱导细胞凋亡:用Annexin V-FITC细胞凋亡法考察PAMAM-HA各样品在在实验浓度下是否可诱导细胞凋亡及凋亡效率与浓度和时间的关系。(6)PAMAM-HA转染机制研究:用不同摄取途径抑制剂考察各复合物进入细胞的途径,将细胞核、溶酶体和DNA分别染色标记用激光共聚焦显微镜观察考察DNA在细胞内的分布。