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为了建立一种操作简单、成本低廉、容易推广的J亚型禽白血病(ALV-J)的鉴别方法,本研究通过细胞培养、ELISA抗原检测、聚合酶链式反应(PCR)以及亚群特异性免疫荧光试验(IFA)鉴定从2008年送检的疑似禽白血病感染的临床样品中分离出的ALV-J毒株ZH-08株。再以病毒接种细胞,提取细胞中前病毒全基因组为模板,利用巢式PCR的方法,扩增大小为941bp的ALV-J特异性基因-gp85基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a中,获得了重组质粒pET32a-gp85。将该重组质粒转入表达菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,再利用切胶回收纯化的方式,获得了大小约为52kDa的重组蛋白gp85。Western-blotting结果表明该重组蛋白能与J亚群特异性单抗JE9发生特异性反应。同时尝试用真核表达系统-杆状病毒表达系统,表达gp85。将gp85基因片段克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual上,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达gp85蛋白。Western-blotting结果表明外源的gp85蛋白在昆虫细胞里成功实现表达。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统能表达非融合蛋白,与原蛋白一致,但是杆状病毒转染率较低,系统表达出的gp85蛋白的表达量远小于原核系统的表达量,出于成本的考虑,本实验对原核表达的gp85蛋白进行纯化,制备单因子血清,以作建立ALV-J特异性检测方法之用。
用纯化后的重组蛋白免疫新西兰兔,获得高效价gp85单因子血清,以辛酸-硫酸铵法提取纯化IgG,以纳氏试剂检测氨基,完全透析出氨基后,取部分用辣根过氧化酶(HRP)标记。用纯化所得血清及经HRP标记的血清建立双抗体ELISA(DAS-ELISA)及Dot-ELISA检测方法,特异性检测ALV-J,并对48份血液样本用DAS-ELISA及Dot-ELISA法进行检测,同时将样本作病毒分离及PCR鉴定,计算其符合率。结果表明,DAS-ELISA方法能检测低至含量为0.165μg/mL,而Dot-ELISA法能检测的最低含量为0.1μg/mL,DAS-ELISA和Dot-ELISA法分别检测ALV-J、ALV-A、ALV-B、REV、NDV、AIV、DEV、IBV,只有ALV-J呈阳性,两法均显示较好的特异性。DAS-ELISA、Dot-ELISA、PCR检测对48份血液样本检测的阳性率分别为50％(24/48)、56.25%(27/48)、56.25%(27/48);DAS-ELISA的阳性符合率为85.2%(23/27),假阳性率为4%(1/24),假阴性率为16.7(4/24)%;Dot-ELISA阳性符合率为96.3%(26/27),假阳性率为7.4%q(/27),假阴性率为4.7%(1/21)。结果表明,Dot-ELISA法比ELISA法敏感性、阳性符合率更高,假阴性率更低。