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纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)是降解纤维素活力较强的菌群,其纤维素酶活力严重依赖于菌体和底物的相互接触。堆囊菌纤维素酶在细胞上的组织形式,一直是研究者感兴趣的内容。另外,本实验室前期研究发现,纤维堆囊菌So0157-2菌株可在碱性条件下(pH>10)生长并降解纤维素。这种发现使本研究推测,纤维堆囊菌So0157-2菌株中,有耐碱性纤维素酶的存在,这为研究耐碱性纤维素酶,提供了良好的研究素材。
本研究利用word文档,Clustal和DNAman等生物信息学软件,针对纤维堆囊菌So0157-2菌株基因组测序获得的5202个重叠群(contigs),创建了一种新颖高效的氨基酸探针虚拟杂交的生物信息学方法,实现从庞大的基因组序列中快速筛选到纤维素酶基因的目的,设计了16组氨基酸序列虚拟探针,共搜索获得26个纤维素降解相关酶类的基因。
经过对纤维堆囊菌So0157-2菌株基因组测序信息的全基因组BLAST比对,全面地分析了纤维堆囊菌中纤维素降解相关酶的种类、数量。完成So ce56基因组注释信息的整理总结,分析纤维素酶在堆囊菌基因组上的分布方式等特征,进一步比较了堆囊菌纤维素酶基因和采取不同纤维素降解策略微生物的纤维素酶基因构成的差异,为进一步阐释堆囊菌纤维素降解特性奠定基础。
在序列分析的基础上,以So0157-2基因组contig00338、02247、01523中的纤维素降解相关酶基因为研究对象,构建了6个表达载体,通过表达条件的优化,实现了一个内切葡聚糖酶在大肠杆菌中的活性表达。这些工作为堆囊菌纤维素酶的异源活性表达积累了经验。解决了在原始菌株中无法获得单组分酶蛋白的困难,为酶蛋白的生化特性分析和抗体制备提供高质量的材料。集中研究该内切葡聚糖酶,测定该酶的反应最适pH为7.3-7.6,最适温度为50℃,酶的比活力为1.662IU/mg,并完成酶热稳定性的测定,证明该酶在50度以下是基本稳定的。
为研究堆囊菌纤维素酶的构成和组织形式,使用ZAP表达载体构建了So9733-1基因组表达文库,文库含4万个克隆子,插入片段大小平均值3.98kb,覆盖度P=0.999982。该成果为活性筛选和序列筛选So9733-1中的纤维素酶基因奠定基础。对构建的So9733-1基因组表达文库开展了活性筛选,结果未获阳性克隆。表明进一步的序列筛选和PCR扩增方法将是获得So9733-1菌株纤维素酶基因的有效途径。
另外,在多种环境土样中分离出17株粘细菌菌株,扩展了粘细菌生存环境的认识,为分析不同环境的粘细菌纤维素酶种类与组成的多样性,更广泛研究不同粘细菌纤维素降解行为间的差异,提供了更多研究材料。
除以上的理论研究意义外,该研究还有一定的潜在应用价值。纤维素酶基因的克隆、异源活性表达和生化特性分析可能为酶蛋白的应用奠定基础,尤其是堆囊菌So0157-2菌株的耐碱性纤维素酶种类,有可能在造纸和纺织等领域获得应用。