近年来，随着喹诺酮类抗菌药在临床抗感染治疗乃至畜牧养殖业中的广泛使用甚至滥用，使临床分离细菌对其耐药率迅速增加。多中心耐药监测的结果显示，我国可能是全球喹诺酮类抗菌药耐药最为严重的国家之一，已给临床抗感染治疗带来严峻挑战。细菌对喹诺酮类药物的耐药主要由染色体介导，包括靶位基因的变异和主动外排机制等。最近Martinez等学者证实了质粒介导的喹诺酮类耐药机制，并将质粒定位的喹诺酮耐药基因命名为qnr，包括qnrA、qnrB和qnrS等亚型，其中以qnrA较为常见。QnrA通过保护DNA回旋酶和拓扑异构酶Ⅳ，不仅可以使细菌对环丙沙星的MIC增加4至32倍，而且可以放大其它耐药机制达数倍至数十倍之多，还可以跨菌种水平传播，加剧了临床致病菌耐药性的播散。引起广泛的关注。因此，①本研究对来自深圳市临床分离肠杆菌科细菌进行qnrA流行情况的调查，并对我市分离的qnrA与已报道的qnrA序列进行比较。进一步考察qnrA的质粒定位。②进一步探讨携qnrA肠杆菌科细菌对喹诺酮的敏感性及其耐药机制的协同作用。③了解携qnrA临床分离菌株的耐药轮廓为临床选择抗菌药物提供依据。 材料和方法 菌株来源： 来自2003-2004年深圳市第六人民医院、深圳市人民医院无重复临床分离菌株。其中大肠埃希菌184株，肺炎克雷伯菌91株，阴沟肠杆菌45株，产气肠杆菌7株，沙门菌5株(大肠埃希菌为环丙沙星不敏感，其它菌株包括环丙沙星敏感或不敏感株)。 方法： 1．使用引物特异性PCR结合测序方法识别qnrA基因和对靶位基因gyrA和parC变异进行检测。 2．序列比较：使用美国国家生物技术信息中心的BLAST程序对所得qnrA序列与已报道序列进行比较。临床分离株扩增的gyrA和parC序列与标准株的gyrA和parC序列比较。　　3．qnrA质粒定位：采用QIAGEN公司质粒提取试剂盒进行质粒提取，提取后进行Southern杂交。 4．qnrA对喹诺酮耐药的介导：通过接合传递实验获得接合子，比较接合子与受体菌对喹诺酮的MIC的差异进行判断。 5．细菌对喹诺酮类药物的敏感性检测：采用琼脂稀释法测定携带qnrA菌株的MIC值。细菌对其它抗菌药物的敏感性检测：采用纸片扩散法(K-B法)。 结果 1．携qnrA细菌的检出率：对环丙沙星不敏感大肠埃希菌184株中均未检出qnrA阳性菌株：肺炎克雷伯菌9l株中检出携qnrA菌4株(4.4％)；阴沟肠杆菌45株中检出携qnrA菌7株(15.6％)；沙门菌5株中检出携qnrA菌1株，7 　　　　株产气肠杆菌中qnrA阳性1株。该批菌总的qnrA检出率为3.91％。 2．对扩增的627bp片断进行测序，使用BLAST程序进行序列比较。所有扩增的序列均为qnrA序列。2株肺炎克雷伯菌与Tran J.H已报道的qnrA基因序列相同，其余菌菌株与我国学者王明贵已报道的qnrA基因序列相同，两者仅相差一个核苷酸(537位CTA→CTG均为亮氨酸)。两者氨基酸序列完全相同。 3．质粒提取、QnrA基因Southern杂交质粒定位：13株qnrA基因阳性菌中，成功提取了11株菌的质粒进行质粒谱分析和Southern杂交检测。包括：阴沟肠杆菌6株；肺炎克雷伯菌3株；耶路撒冷沙门氏菌l株；产气肠杆菌1株。以qnrA基因为模板制备探针进行Southern杂交检测显示，qnrA基因大约定位在80<~>180kb大小的低拷贝数天然质粒上。 4. 临床分离携qnrA菌株(供体菌)、接合菌和受体菌对喹诺酮的MIC<,50>比较可知：接合子获得质粒后对喹诺酮类药物的敏感性明显下降，MIC<,50>提高8-32倍。 但结合子与临床分离株比较尚有较大差距，MIC<,50>相差4-16倍。 5.携qnrA临床分离菌株对喹诺酮类药物的敏感性差异很大，其MIC从0.5μg/ml-大于128μg/ml不等。“第四代”喹诺酮与第三代喹诺酮比较，敏感率有所提高。 6．携带qnrA的接合菌株对喹诺酮的MIC与临床分离株Kp51、K：p034、Ec53接近，而这些临床分离菌株(除Kp51外，Kp5l发生$83T变异，但MIC仅为0.5μg／ml)未发现有意义的靶位基因的变异，这些菌株在药敏上均表现为“敏感”。Ec72、Ec28、Ec66、Ec23存在gyraseAS83Y的变异，在药敏上表现为“耐药”或“中介”。Kpl50同时存在gyraseA和parC基因的变异，其MIC又明显高于Ec72、Ec28、Ec66、Ec23等菌株，表现为高度耐药。 7．qnrA阳性细菌具有多重耐药的特性，对第3代喹诺酮类、广谱β-内酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类、氯霉素及四环素抗菌药的耐药率较高；但对第4代喹诺酮抗菌药，如：加替沙星和莫西沙星，以及亚胺培南和哌拉西林/他唑巴 坦较为敏感。 结论 1．来自深圳的对环丙沙星不敏感的大肠埃希菌中未发现qnrA的流行而肺炎克雷伯菌及阴沟肠杆菌中发现qnrA的流行，流行率分别为4.4％和15.6％，该地区qnrA还存在于沙门菌及产气肠杆菌中。深圳地区的qnrA氨基酸 序列与上海或美国报道的序列一致，qnrA呈高度的保守性。qnrA定位于60-180kb的质粒。 2. 本研究揭示不同的携qnrA的菌株对喹诺酮的敏感性表现出显著的差异性。同一菌株对不同的喹诺酮的敏感性也有一定的差异，但对第四代喹诺酮的敏感率高于第三代喹诺酮。 3．qnrA介导低水平的喹诺酮耐药，单纯携带qnrA不足以造成对氟喹诺酮的临床耐药性。qnrA介导的耐药性与gyraseA和parC基因变异介导的耐药机制 之间有明显的协同效应。 4．携qnrA菌株具有多重耐药和产ESBLs的特性，临床上可选择含酶抑制剂的复合制剂和碳青霉烯类抗菌药治疗该类细菌感染。