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栀子是一种传统中药,年用量较大,自汉书记载有栽培栀子以来已有两千多年的栽种历史;加之上个世纪六七十年代开垦荒地,破坏了大量的野生资源。开展栀子遗传多样性及道地性的研究有利于资源的保护和可持续利用。DNA分子标记是研究遗传多样性有力的工具。本文首先应用AFLP标记和RAPD标记,分别建立适合于栀子的AFLP标记和RAPD标记的反应体系和反应程序,结合系统聚类和主成分分析方法,对8个不同产地的92份材料进行分析研究。其次,建立了不同产地的栀子高效液相指纹图谱,并测定了栀子苷的含量。最后,应用主成分分系和相关分析,初步确定了与栀子苷含量相关的环境因子。主要结果如下:
1、药用植物通常含有多种次生代谢产物,这些次生代谢产物影响了DNA的提取和AFLP扩增。本文以药用栀子为试材,建立了AFLP反应体系并对其进行了优化。该体系适合于栀子及其近缘属种的AFLP研究。
2、应用AFLP标记技术对栀子8个种群遗传多样性和遗传分化进行研究。从64对引物中选出8对扩增条带清晰、重复性较好的引物对92个个体进行检测,共得到244个可重复的位点,其中多态位点165个,多态百分率为67.6%,表明物种水平的遗传多样性较高。Shannon指数和Nei指数均反映出栀子各种群内具有较高的遗传多样性。Shannon指数为0.4313,各种群Shannon指数在0.2086~0.3520之间,Nei指数为0.2892,各种群Nei指数在0.1403~0.2341之间。AMOVA揭示种群内遗传多样性占总遗传多样性的85.37%(P<0.0010),而种群间遗传多样性只占14.63%,栀子种群间的基因流为1.7448。
3、应用RAPD标记技术对栀子8个种群遗传多样性和遗传分化进行研究,建立了适合栀子的RAPD反应体系及程序。运用18个随机引物对92个个体进行检测,应用POPGENE软件和AMOVA软件对结果进行处理。共得到120个可重复的位点,其中多态位点75个,多态百分率为62.5%。种群间的遗传分化系数为0.3066。栀子种群间的基因流为1.1306,遗传相似度平均为0.12909,遗传距离平均为0.88072。根据遗传距离聚类分析,RAPD标记与AFLP标记得到的聚类结果基本一致。通过AFLP分析和RAPD分析遗传多样性可知:目前虽然野生资源逐年减少以及多年栽培中的品种选育,栀子遗传多样性仍较丰富,且种群内大于种群间,种群间存在较少的遗传分化。同时,对AFLP标记和RAPD标记进行了分析比较。
4、建立了江西道地药材栀子的HPLC指纹图谱,并将不同产地的栀子药材进行指纹图谱相似度计算。该方法能简便、快速的鉴别和区分不同来源的栀子药材,为全面控制栀子药材的质量提供了依据。
5、用主成分分析方法对8个栀子不同产地土壤中13种矿质元素及药材中12种矿质元素进行了多因素分析。结果表明:Mg与栀子苷的含量之间呈显著正相关,pH与栀子苷含量之间呈显著负相关。道地性的产生是遗传和环境饰变共同作用的结果。本研究从分子标记、化学成分及矿质元素三方面进行分析和探讨,为道地性研究提供了研究思路和科学依据。