拟南芥ANK-TM基因克隆及功能分析

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自然条件下,植物生长在开放的环境中,经常会遭遇到环境条件的剧烈变化,其幅度超过了适于植物正常生命活动的范围,比如低温,高温,干旱,水涝,盐碱,大气污染,水质污染等,这些不良因素作用于植物,将会引起植物体内产生一系列的生理代谢反应,因此阐明植物对耐受逆境胁迫的分子机制和改良植物的抗逆性已经成为当前农业研究的主要目标之一。而拟南芥(Arabidopsis thaliana)作为模式植物,已被广泛应用于植物分子生物学遗传学和发育生物学的研究。拟南芥的未知功能基因的研究通常是通过转基因技术进行。锚蛋白重复序列(ankyrin repeats)是普遍存在于生物体中的介导蛋白与蛋白相互作用的一种结构域。具有这种结构域的蛋白参与转录的启动、细胞周期的调控、细胞骨架系统的形成及离子的运输和信号转导。跨膜结构域在生物体中也担负着各种各样的重要功能。本研究应用分子生物学分析并构建了拟南芥未知功能基因ANK-TM4.1-4.8的各种植物表达载体,转化农杆菌之后浸染花序,获得了转基因植株,为进一步研究该基因的功能是否具有抗各种逆境胁迫的功能奠定了基础。主要的研究结果如下:  (1)利用Gateway技术构建各种表达载体及转化拟南芥:以pGWB406,pGWB502Ω,pGWB533这三种表达载体为基础,分别构建了拟南芥ANK-TM4.1-4.8这八个基因的GFP融合表达载体,超表达载体,以及GUS融合表达载体。然后用花絮浸染法转化拟南芥,在含有Basra抗性的1/2MS的培养基上筛选T1代转基因植株。目前正在筛选T2代转基因植株。  (2)利用T-DNA插入突变体研究这些基因的功能:从ABRC购买到相应ANK-TM4.1-4.8这八个基因的T-DNA插入突变体,通过PCR鉴定获得相应突变体的纯合体,目前八个基因中,已经有5个获得了纯合突变体,种子在进一步扩繁中,准备用于下一步的生理表型鉴定。  (3) RT-PCR检测ANK-TM4.1-4.8的T-DNA插入纯合突变体中目标基因表达量的变化。4.1,4.2,4.5,4.8这4个基因的T-DNA插入都导致目标基因在表达量显著降低,只有4.6的T-DNA插入突变体为超表达株系。
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